核酸（nucleic acid）在生物界中堪稱主宰，是一類非常重要的生物大分子莹痢，它在生物的繁衍、發(fā)育墓赴、維持竞膳、衰老和死亡等一切生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，如果其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)稍許的變動(dòng)诫硕，比如一個(gè)堿基的差錯(cuò)坦辟、缺失或增加，就有可能導(dǎo)致突變章办、缺陷或疾病的出現(xiàn)锉走，所以核酸已成為生物化學(xué)、遺傳學(xué)以及其他有關(guān)生命學(xué)科的熱門研究課題藕届，其覆蓋面之廣挪蹭、進(jìn)展之速為其他學(xué)科所望塵莫及。而進(jìn)行核酸研究的第一個(gè)前提就是能夠?qū)⒑怂釓谋姸嗉姺睆?fù)雜的生物大分子中提取出來翰舌，并純化到一定程度嚣潜，以便進(jìn)行相應(yīng)的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用。核酸椅贱，快到“管”里來系列共分六期來和大家共同分享一下核酸提取樣品制備懂算、提取方法及檢測方面的知識只冻，以期能夠?qū)Υ蠹业目蒲杏兴鶐椭１酒诤痛蠹曳窒淼氖荝NA提取相關(guān)的知識點(diǎn)计技，不足之處請多多包涵喜德。
1、RNA是什么
核糖核酸（縮寫為RNA垮媒，即Ribonucleic Acid）舍悯，存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體睡雇。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子萌衬。一個(gè)核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成它抱。RNA的堿基主要有4種秕豫，即A腺嘌呤、G鳥嘌呤观蓄、C胞嘧啶混移、U尿嘧啶。
2侮穿、RNA有哪些種類
在細(xì)胞中歌径，RNA種類繁多（具體見下面模式圖）。根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同亲茅，RNA主要分三類回铛，即tRNA、rRNA克锣，以及mRNA勺届。mRNA是依據(jù)DNA序列轉(zhuǎn)錄而成的蛋白質(zhì)合成模板；tRNA是mRNA上遺傳密碼的識別者和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)者娶耍；rRNA是組成核糖體的部分娩嚼，而核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所乐设。
細(xì)胞中還有許多種類和功能不一的小型RNA德绿，像是組成剪接體（spliceosome）的snRNA与殃，負(fù)責(zé)rRNA成型的snoRNA菌瘪，以及參與RNAi作用的miRNA與siRNA等烈疚，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)该互。而其他如I吁系、II型內(nèi)含子药版、RNase P辑舷、HDV、核糖體RNA等等都有催化生化反應(yīng)過程的活性槽片，即具有酶的活性何缓，這類RNA被稱為核酶肢础。
3、RNA提取的原則
1. 保證RNA一級結(jié)構(gòu)的完整性碌廓；
2. 提取的RNA樣品中不應(yīng)存在對酶存在抑制作用的有機(jī)溶劑及過高濃度的金屬離子传轰；
3. 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度谷婆；
4. 排除其它核酸分子（DNA）的污染慨蛙。
4、常用RNA提取方法
（一）TRIzol法
1. TRIzol裂解液主要成份及其作用
TRIzol主要成分：苯酚和異硫氰酸胍纪挎。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞期贫，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放异袄。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)通砍，但不能完全抑制RNA酶活性。異硫氰酸胍是強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑隙轻，既能迅速溶解蛋白質(zhì)埠帕，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離玖绿，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用敛瓷。至于TRIzol試劑的顏色，通常為粉紅色斑匪，其作為一種指示劑呐籽，為了使抽提后分層更好區(qū)分。
2. 氯仿在RNA抽提過程中的作用
苯酚對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿蚀瘸，但是酚的比重略比水重狡蝶，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層贮勃，不利于含RNA的水相的回收贪惹；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層寂嘉，方便水相的回收奏瞬；另外酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提泉孩，抽提后仍有大量的酚溶解到水相中硼端，其會抑制后續(xù)的酶促反應(yīng)，因此單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除寓搬。
組織勻漿后加氯仿分相時(shí)珍昨，因TRIzol試劑pH<5.2，則DNA優(yōu)先分配于有機(jī)相，水相則是RNA镣典，組織蛋白以及部分核蛋白+大片段基因組變性以沉淀形式形成中間相兔毙。
3. 不同沉淀劑的作用原理及應(yīng)用
異丙醇沉淀原理是降低了介電常數(shù)，破壞了了核酸分子表面的水化層骆撇。另外還可以利用等電點(diǎn)法和鹽析法沉淀瞒御，如利用醋酸鈉（3M，pH5.2）神郊，一方面高鹽濃度破壞核酸分子水化層肴裙，另一方面使其接近核酸等電點(diǎn)（核酸的等電點(diǎn)比較低，如DNA的等電點(diǎn)為4～4.5涌乳，RNA的等電點(diǎn)為2～2.5）蜻懦。
乙醇和異丙醇相比，因?yàn)閮烧呋瘜W(xué)性質(zhì)都是醇類夕晓，沉淀原理是相似的宛乃。異丙醇沉淀法一般不需要等溫放置很長時(shí)間；其缺點(diǎn)是易使鹽類與核酸共沉淀蒸辆，而且異丙醇難以揮發(fā)除去征炼，必須用75%乙醇洗滌；無水乙醇沉淀沉淀的鹽少躬贡，且易揮發(fā)除去谆奥；缺點(diǎn)是總體積較大，需要陽離子如Na離子的存在拂玻，并且加2-2.5倍體積的無水乙醇酸些，需在-20℃放置很長時(shí)間，30分鐘-1小時(shí)檐蚜。
乙醇/異丙醇沉淀的方式能夠使不同分子量大小的RNA均沉淀下來魄懂，適合所有RNA建庫項(xiàng)目。對于預(yù)期濃度較低的樣品闯第，可適當(dāng)加入醋酸鈉市栗、糖原或線性丙烯酰胺等助沉劑；氯化鋰不能有效沉淀小分子量的RNA咳短，故不適用于小RNA建庫項(xiàng)目肃廓。
（二）TRIzol+過柱法
核酸純化柱（Spin column）可以用于各種材料的DNA\RNA的提取以及精制。具有操作簡單诲泌、回收率高、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)铣鹏，目前產(chǎn)品已經(jīng)為國內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和公司使用敷扫。核酸純化柱（Spin column）采用硅膠膜作為核酸的特異性吸附材料，而對其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收樣品中的DNA\RNA葵第，同時(shí)去除其他雜質(zhì)绘迁。對于雜質(zhì)組份不清楚，雜質(zhì)含量較多的樣品卒密，可考慮采用TRIzol裂解缀台，氯仿抽提，然后過柱純化的方式進(jìn)行提取哮奇，一般可顯著改善提取樣品的純度膛腐。
（三）CTAB+過柱法
CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子型表面活性劑鼎俘，可溶解細(xì)胞膜使細(xì)胞裂解哲身。在高鹽溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB可與蛋白質(zhì)和中性多糖形成復(fù)合物而沉淀贸伐，不能沉淀核酸和酸性多糖勘天。對于果肉、果皮等富含多糖多酚且較難裂解的樣品捉邢，可采用CTAB裂解液在55℃條件下進(jìn)行裂解脯丝，再以過柱的方式進(jìn)行純化，一般可得到純度及完整性都很理想的RNA樣品伏伐。
（四）試劑盒法
現(xiàn)在市面上有用于各種植物宠进、動(dòng)物、微生物的RNA提取的試劑盒秘案。像QIAGEN砰苍、天根、艾德萊等國內(nèi)外廠家阱高，均有不同應(yīng)用方向的提取試劑盒可供選擇赚导，且質(zhì)量較佳。但在具體工作中需要注意的是赤惊，使用時(shí)一定要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要購買專用提取試劑盒吼旧，如果不是專用試劑盒，或許能提出RNA未舟，但不能確保其質(zhì)量以及完整性圈暗，會影響RT-PCR、Northern blot裕膀、Dot blot员串、Real time RT PCR、芯片分析昼扛、polyA 篩選寸齐、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析、分子克隆等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果渺鹦。
本篇至此分享完畢扰法，同DNA提取一樣，需要強(qiáng)調(diào)的是RNA提取方法及策略并不是一成不變的毅厚，在實(shí)際的工作中我們可以根據(jù)所提取材料的不同塞颁、提取結(jié)果的差異靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，目的只有一個(gè)吸耿，提取到純度高祠锣、完整性好、得率高的RNA樣品珍语，以滿足我們后續(xù)的科研需求
