一凄鼻、核酸

核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細(xì)胞最基本和最重要的成分喂分。一般認(rèn)為锦庸，生物進(jìn)化即始于核酸，因?yàn)樵谒猩镔|(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制蒲祈。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者甘萧。一種生物的藍(lán)圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的梆掸。他當(dāng)時(shí)稱之為核素扬卷。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認(rèn)識(shí)其酸性后，定名為核酸酸钦。

二邀泉、核酸的分類和功能

核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)钝鸽，但生物功能不同汇恤。

DNA貯存遺傳信息，在細(xì)胞分裂過程中復(fù)制拔恰，使每個(gè)子細(xì)胞接受與母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信息含量相同的DNA因谎；RNA主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負(fù)責(zé)將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列颜懊。

核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸财岔，核苷酸含有含氮堿基风皿、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷匠璧，核苷的磷酸酯為核苷酸桐款。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖夷恍；DNA不含核糖而含D-2-脫氧核糖(核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代)魔眨。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同酿雪。

三遏暴、核酸的理化性質(zhì)

RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物指黎。除肌苷酸朋凉、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味醋安。DNA杂彭、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水吓揪，不溶于乙醇亲怠、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水磺芭，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L醉箕，呈黏性膠體溶液钾腺。在酸性溶液中，DNA讥裤、RNA易水解放棒，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中己英。**要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)间螟，先把DNP抽提出來，再把P除去损肛，再除去細(xì)胞中的糖厢破，RNA 及無機(jī)離子等，從中分離DNA治拿。

四摩泪、細(xì)胞裂解：

（一）裂解原理在核酸提取過程中，細(xì)胞裂解是非常重要的劫谅。

經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS见坑、Triton X-100嚷掠、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris荞驴、EDTA不皆、NaCl 等)。鹽的作用熊楼，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)霹娄，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對(duì)核酸的破壞 (如EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 等孙蒙。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性项棠，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中挎峦。裂解體系中還可能加入蛋白酶香追，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開坦胶，同時(shí)透典，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如GIT顿苇、GuHCl 等) 裂解的峭咒，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流纪岁。

（二）細(xì)胞的裂解方法 細(xì)菌細(xì)胞破碎方法有以下幾種： 1）機(jī)械方法：超聲波處理法凑队、研磨法、勻漿法幔翰。關(guān)于超聲波處理法漩氨，要設(shè)定好超聲時(shí)間和間隙時(shí)間，一般超聲時(shí)間不超過5秒遗增，間隙時(shí)間最好大于超聲時(shí)間叫惊。 2）化學(xué)試劑法：用含SDS或CTAB的溶液處理細(xì)胞，在一定的pH環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相做修，pH環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿(NaOH)或緩沖液( TE霍狰、STE等)提供，表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解饰及、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA等)可螯合對(duì)核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 蔗坯、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。 3）反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍燎含，室溫融解步悠，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹瘫镇，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎鼎兽。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)一般情況答姥，37℃,3min，液氮3min,反復(fù)三次即可以谚咬。 4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶鹦付、蛋白酶K等，都可使細(xì)胞****壁破碎择卦，核酸釋放敲长。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解秉继。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 ℃及有EDTA祈噪、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保留酶活性,這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中,酶作用尚辑、機(jī)械作用辑鲤、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型杠茬、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定月褥。

（三）裂解方法的評(píng)價(jià)

含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選瓢喉。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的游離宁赤。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對(duì)蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用栓票；同時(shí)决左，巨大的基因組DNA 是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后走贪，則不容易被基因組 DNA “纏”住佛猛，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高厉斟。另外一個(gè)思路是挚躯，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì) “纏”在一起强衡，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢(shì)擦秽，則純化時(shí)以 DNA 的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留漩勤；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢(shì)感挥，則純化時(shí)以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失越败。當(dāng)然去污劑裂解方法触幼，仍然在細(xì)胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢(shì)，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡呔糠桑?jīng)濟(jì)性及操作簡(jiǎn)單很重要時(shí)置谦。控制好裂解液****/****樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵堂鲤。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡(jiǎn)單的操作媒峡，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會(huì)比用PC抽提的差一些瘟栖。

高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法谅阿，是抽提 RNA 的首選半哟。總 RNA 的抽提签餐，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜寓涨，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì) “纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫?huì)對(duì)以后的純化產(chǎn)生大的影響氯檐，可以不考慮戒良。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA 酶男摧，從而確保了 RNA 的完整性蔬墩。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提耗拓，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的拇颅。當(dāng)然有些樣品，如肌肉乔询，即使是 RNA 抽提樟插，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個(gè)時(shí)候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)) ，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)竿刁，是非常難以去除的黄锤。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。

含 CTAB 的裂解液食拜，幾乎成為富含多糖的樣品鸵熟，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法负甸。該方法成功與否與兩個(gè)因素有關(guān)：一是CTAB 的質(zhì)量流强，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對(duì)裂解效率有很大的影響呻待，而且打月，似乎還說不清楚原因，因?yàn)榧词故峭还旧a(chǎn)的純度一樣的 CTAB蚕捉，批號(hào)不同拗引，效果就可能差別很大传惠。洗滌去除CTAB 要比其它的鹽難一些双吆，同時(shí)甸鸟，CTAB 的少量殘留也會(huì)對(duì)酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時(shí)的溫度，多使用 65C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低梗脾，可以試一下 37C – 45C 這個(gè)相對(duì)低溫的區(qū)域。

SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法盹靴，具有快速炸茧、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點(diǎn)稿静∷蠊冢控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4C會(huì)更好一些改备，所以控漠，加入溶液 III 后在 4℃靜置一段時(shí)間以及采用 4℃離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量悬钳。該方法不一定要使用 PC 純化盐捷，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒默勾。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 來實(shí)現(xiàn)碉渡。總的感覺是母剥，在溶液 I 中使用 RNase A滞诺，RNA 的殘留少一些。不過环疼，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除RNA 殘留习霹。另外，對(duì)大質(zhì)粒 (50 kb 以上)炫隶，該方法可能會(huì)有問題淋叶。

PCR 模板的簡(jiǎn)易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法伪阶。該方法的特點(diǎn)是無須純化煞檩，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非惩牛快速形娇。也正因?yàn)椴患兓趟猿镂螅訇幮?(即沒有擴(kuò)增出來的陽性) 比例也比較高。該方法最簡(jiǎn)單的就是反復(fù)凍融法癣缅，簡(jiǎn)便快捷厨剪，不需任何化學(xué)試劑哄酝，凍融離心，PCR檢測(cè)就可以了祷膳。如果使用裂解法陶衅，哪么最簡(jiǎn)單的裂解液就是水，復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有一些不會(huì)抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)直晨，而且能提高裂解效率搀军，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制 PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100勇皇、甲酰胺等罩句。再復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有諸如 Chelex 100 之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡(jiǎn)單敛摘，多使用溫度的變化來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解门烂，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等兄淫。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品屯远，但卻不適合用于判斷某一個(gè)樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率捕虽，因?yàn)闃悠妨康慕档涂ぃ瑫r(shí)意味著 PCR 的抑制物量的降低。

裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品泄私，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中咖气。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低挖滤，影響得率崩溪；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底斩松，導(dǎo)致純度下降伶唯。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的惧盹，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)乳幸，這一點(diǎn)務(wù)必牢記。

五钧椰、核酸純化

就個(gè)人所知粹断，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的嫡霞，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開瓶埋；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)养筒。

1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相曾撤，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據(jù)應(yīng)用目的晕粪，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡(jiǎn)單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離挤悉。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相，核酸則被留于上層水相巫湘。酚是一種有機(jī)溶劑装悲，預(yù)先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會(huì)吸收水相而帶走一部分核酸尚氛。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)衅斩；故在制備酚飽和液時(shí)要加入一特殊物質(zhì)，以防止酚氧化怠褐。氯仿可去除脂肪畏梆，使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡奈懒。核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子奠涌。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀磷杏，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5.5 溜畅，終濃度為0.3M的NaAc 或KAc 后，鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷极祸，在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性慈格。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時(shí)間的孵育，可使核酸有效地沉淀遥金。其他的一些有機(jī)溶劑（異丙醇浴捆、聚乙二醇( PEG) 等）和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰稿械、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀选泻。

2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上美莫；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后页眯，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的乙醇/異丙醇沉淀厢呵、乙醇洗滌窝撵、干燥等操作，獲得純的核酸襟铭，溶解于合適的緩沖液中碌奉。 3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱短曾，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后道批，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)入撒。 4) 密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析隆豹。雙鏈DNA、單鏈DNA茅逮、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度璃赡，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備献雅，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認(rèn)為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法碉考。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射挺身，產(chǎn)生熒光而被檢測(cè)侯谁，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸章钾。

（二）純化方法評(píng)價(jià)

PC(P是英文酚的縮寫墙贱，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀方法，是一個(gè)永不過時(shí)的方法贱傀。穩(wěn)定惨撇、可靠、經(jīng)濟(jì)府寒、方便魁衙。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽株搔，對(duì)于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))剖淀，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC 抽提都會(huì)損失一部分核酸 (因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫?纤房，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低祷蝌，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提帆卓。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個(gè)非常有效的手段巨朦。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出剑令，處于苯酚中或者苯酚/水相之間糊啡。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底吁津，二要用量足夠棚蓄。徹底混勻堕扶，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性梭依。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會(huì)對(duì)核酸稍算，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實(shí)際上大可不必如此小心役拴。劇烈的混勻操作糊探，是會(huì)部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會(huì)強(qiáng)烈到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段河闰。手劇烈晃動(dòng)混勻后科平，基因組 DNA 的片段，大部分會(huì)大于 20kb姜性，這個(gè)大小瞪慧，除了一些特別的要求外，對(duì) PCR 和酶切部念，都是完全適用的弃酌。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用儡炼，則不能使用劇烈的混勻方法矢腻，而只能來回溫和顛倒混勻 – 此時(shí)的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠射赛。用量要足夠多柑，是因?yàn)楸椒尤コ鞍踪|(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度楣责，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會(huì)被一次去除竣灌，必須靠多次抽提，方可徹底去除秆麸。另外初嘹，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除沮趣，以及基因組 DNA 會(huì)斷裂得更厲害屯烦，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)房铭。PC 抽提的另外一個(gè)用途是驻龟，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時(shí)獲得 DNA 殘留極少的 RNA缸匪。不過有一點(diǎn)要提醒的是翁狐，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前凌蔬，是不能使用 PC 抽提的露懒，否則核酸必定降解闯冷。

高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個(gè)非常不錯(cuò)的方法懈词。與 PC 抽提方法相比蛇耀，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點(diǎn)坎弯。更快纺涤、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提荞怒，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定洒琢。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會(huì)更好一些秧秉。

介質(zhì)純化方法褐桌，是一個(gè)越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提象迎，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶∮叮兌鹊姆€(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量砾淌。介質(zhì)可以分為兩大類啦撮，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里汪厨；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk赃春、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大劫乱，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程织中，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸衷戈。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程狭吼，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會(huì)進(jìn)入另外一個(gè)離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的殖妇，所以洗滌更徹底刁笙，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)谦趣。不過疲吸，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。

（三）醇的沉淀

1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來前鹅，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離磅氨。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量嫡纠，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的烦租。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)延赌，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽叉橱，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來挫以；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來 (當(dāng)然窃祝，得率可能會(huì)降低)掐松。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反粪小，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 – 主要是純度問題時(shí)大磺，完全可以通過調(diào)整沉淀?xiàng)l件來改善。最有參考價(jià)值的是的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇探膊，可以大大降低多糖殘留杠愧。另外一個(gè)問題就是，要堅(jiān)信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程逞壁；調(diào)整醇沉淀的條件流济，雖然會(huì)降低核酸的得率，但因?yàn)榭梢源蟠筇岣呒兌取?/p>

2. 沉淀劑的選擇：醇沉淀使用異丙醇還是乙醇腌闯，我們并沒有發(fā)現(xiàn)這二者對(duì)質(zhì)量有大的影響绳瘟。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊姿骏，顏色不是很白糖声；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動(dòng)分瘦，顏色比較白蘸泻。這是現(xiàn)象，少量核酸用異丙醇沉淀擅腰，大量核酸用乙醇沉淀蟋恬。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我們沒有碰到過趁冈，我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底歼争。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點(diǎn)是體積小渗勘，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml 離心管內(nèi)完成沐绒。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時(shí)其中心部分不容易被洗滌到旺坠，所以乔遮，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時(shí)間使沉淀最終變成蓬松的白色取刃。如果再洗滌一次蹋肮，質(zhì)量決不會(huì)有問題的出刷。當(dāng)然，沉淀所用的試劑坯辩，不僅僅就乙醇和異丙醇馁龟，還有包括PEG、LiCl漆魔、CTAB 都可以用于核酸沉淀坷檩，雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)改抡。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA矢炼，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段阿纤。 3) 沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時(shí)句灌，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時(shí)阵赠，效果明顯涯塔；當(dāng)核酸濃度比較高時(shí)肌稻，效果不明顯清蚀，但卻會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。

（四）核酸的洗滌

1）洗滌原理與目的：洗滌對(duì)于整個(gè)提取過程來說爹谭，也是非常重要的枷邪。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來诺凡；第二就是要控制一定的時(shí)間东揣，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí) (使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次腹泌；第四則是去上清要徹底嘶卧。大部分資料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一說法凉袱，對(duì)于質(zhì)量好的離心管芥吟，如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁专甩，所以上清可以去除得非常徹底钟鸵；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化涤躲，殘留量也非常少棺耍，也沒有什么問題；差的管子种樱，液體的掛壁非趁膳郏可觀俊卤，其殘留量多到會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。避免液體殘余的一個(gè)好方法害幅，就是倒掉液體后再短暫離心瘾蛋，將殘液用移液器吸出。還有需大家牢記的是矫限，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)哺哼，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)叼风。揮發(fā)時(shí)去掉的是乙醇取董，雜質(zhì)是不會(huì)被揮發(fā)去除的。這步无宿，切忌不要用手甩茵汰，這樣容易將核酸甩掉。另外孽鸡，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度蹂午。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)彬碱，洗滌越要徹底：放置時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一點(diǎn)豆胸，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然巷疼，乙醇濃度的選擇也非常重要晚胡，一般情況，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇嚼沿。

（五）核酸的溶解和保存

1）核酸溶解：純化后的核酸估盘，其中 RNA 以水溶解為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解骡尽。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解遣妥，其中原因是有人認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的DNase 降解的風(fēng)險(xiǎn)；如果操作過程控制得當(dāng)攀细，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的箫踩，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。

2）核酸保存：基本上辨图，核酸在保存中的穩(wěn)定性班套，與溫度成反比，與濃度成正比故河。一般的我們選擇吱韭，-20℃或70℃保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失理盆，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解痘煤，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解(RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)猿规。還有一個(gè)不為人重視的衷快，就是EP ****管對(duì)核酸的影響。首先一定要堅(jiān)信一點(diǎn)姨俩，那就是核酸一定會(huì)與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)蘸拔，達(dá)到某種均衡。EP ****管的材質(zhì)环葵，首先可能吸附核酸调窍，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性张遭。在核酸的濃度比較高時(shí)邓萨，這個(gè)現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時(shí)菊卷，則比較明顯了缔恳。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明洁闰，但許多實(shí)驗(yàn)人員并沒有將該建議當(dāng)回事∏干酰現(xiàn)在制造 EP 管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料渴庆，在強(qiáng)度铃芦、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質(zhì)要好許多雅镊，但其化學(xué)特征襟雷，尤其是對(duì)核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠(yuǎn)沒有研究透徹仁烹。正如現(xiàn)在的質(zhì)了逝可以改造得越來越適用某些要求一樣，其負(fù)面產(chǎn)物可能是卓缰，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外计呈，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型征唬。

（六）核酸的濃縮

應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法捌显。在中等濃度單價(jià)陽離子存在下，加入一定量的乙醇后总寒，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收扶歪，甚至對(duì)低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收摄闸∩屏回收的核酸可按所需濃度妹萨，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。 核酸濃縮的具體操作時(shí)炫欺，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價(jià)陽離子鹽貯存液2V無水乙醇乎完，混勻，放冰水浴中15～30min品洛，取出目測(cè)平衡树姨，0～4度，12000g桥状，離心10min娃弓。吸棄上清，再另70%乙醇0.5～1ml岛宦，12000g台丛，0～4度洗滌離心2min。吸棄上清砾肺，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后挽霉，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。單價(jià)陽離子鹽的選擇变汪，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀侠坎，但在以后要作核酸的磷酸化時(shí)應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T裙盾，多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑实胸。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時(shí)，常用LiCl番官，因LiCl在乙醇中溶解度很高庐完，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品徘熔，應(yīng)使用NaCl门躯，這時(shí)該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀酷师，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）讶凉。

六、核酸質(zhì)量的檢測(cè)問題

將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)山孔，是唯一可靠的檢測(cè)方法懂讯；除此之外的檢測(cè)方法，都是相對(duì)的台颠，而且并不十分可信褐望。目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀譬挚。電泳檢測(cè)的主要是核酸的完整性和大小锅铅，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非臣跣可信的盐须；電泳還可以用于估計(jì)核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)漆腌；另外贼邓，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)闷尿。紫外分光光度儀檢測(cè)的是純度和核酸含量塑径，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確填具，而該儀器的靈敏度又非常高统舀，所以，提供的結(jié)果并不十分可信劳景。一般講誉简，同時(shí)進(jìn)行紫外和電泳檢測(cè)，綜合二者的結(jié)果盟广，可以做出一個(gè)更合理的判斷闷串。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷，所以筋量，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)烹吵，也不用大驚小怪。 關(guān)于紫外分光光度儀的檢測(cè)桨武。首先肋拔，不要使用不能選擇波長(zhǎng)的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長(zhǎng)的儀器玻募，大概可以算是你夢(mèng)魘的開始 (沒有信息是可怕的只损，更可怕的是將錯(cuò)誤的信息當(dāng)真，其中280七咧、320、230叮叹、260nm下的吸光度分別代表了核酸艾栋、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值蛉顽。)蝗砾。其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；最后悼粮，要記住讀數(shù)A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 為 1.8) ：1 為理論上的數(shù)據(jù)闲勺，實(shí)際測(cè)定時(shí)會(huì)有一些差別；但如果差別太大扣猫，就有問題了菜循，有兩個(gè)值得商榷的觀點(diǎn)：如果 A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解申尤。A260/A230 如果比2.0 大許多癌幕，一定是有雜質(zhì)殘留的 (具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測(cè)定昧穿，A260/A280 > 2.0 決不提示核酸降解勺远，原因是：那些能導(dǎo)致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的时鸵；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280 實(shí)際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值胶逢。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底饰潜，在 A260 是峰頂宪塔，在 A280 則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚∧野荩诎肷狡碌男甭首畲蟮奶攸c(diǎn)某筐，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260 的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大冠跷。關(guān)于電泳檢測(cè)南誊，觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡(jiǎn)單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)蜜托，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近抄囚，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加橄务。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料幔托，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下蜂挪，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來重挑。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的DNA棠涮。

建議先電泳檢測(cè)谬哀，再用紫外分光光度儀檢測(cè)。電泳后严肪，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)史煎，以及核酸的大致濃度谦屑，這樣就為紫外分光光度儀的檢測(cè)提供了一個(gè)參考 (降解的不必要測(cè)了，要測(cè)的該取多少量等)篇梭。

七氢橙、核酸中雜質(zhì)的去除

對(duì)于一些對(duì)核酸純度要求較高的實(shí)驗(yàn)，我們就需要對(duì)其進(jìn)行特殊的處理恬偷，除去其中的多糖悍手、蛋白質(zhì)及非目的核酸，其方法如下： 　　
（1）肝糖元喉磁、淀粉及粘多糖谓苟，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來协怒。除去的方法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量涝焙，如先使動(dòng)物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細(xì)胞內(nèi)肝糖元大大減少孕暇。②加入淀粉酶仑撞，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去妖滔。③在濃磷酸鹽存在下隧哮，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相座舍，核酸在上面有機(jī)層中沮翔。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理曲秉，使之形成DNA鉀鹽回收采蚀，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離承二。 　　
（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細(xì)胞內(nèi)以核蛋白體形式存在榆鼠，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中亥鸠。因此妆够，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉负蚊，從提取到分離純化各階段均可反復(fù)使用此法神妹。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加理想盖桥。②氯仿-戊醇或辛醇對(duì)提取液搖蕩抽提灾螃，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去揩徊，核酸留在水溶液中腰鬼。此法在分離純化中也常反復(fù)使用。③苯酚水溶液抽提塑荒，在對(duì)氨基水楊酸等陰離子化合物存在下熄赡，DNA或RNA都可以進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)則沉淀于酚層齿税，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA彼硫，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。
（3）不同類型核酸的分離：兩種類型核酸的制備過程中凌箕，DNA制品中混雜著少量RNA或RNA制品中混雜著少量DNA是經(jīng)常發(fā)生的拧篮。由于DNA和RNA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都很相似，而且分子量都十分大牵舱，所以兩類核酸的分離是核酸純化工作中比較復(fù)雜和繁瑣的一步串绩。從DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，這是比較有效的方法芜壁，但使用的核糖核酸酶中常含有極微量的脫氧核糖核酸酶礁凡，必須事先加熱處理除去，然后將純凈的核糖核酸酶與樣品溶液一起在37℃孵育數(shù)分鐘慧妄，就可達(dá)到破壞RNA的目的顷牌。②鈣鹽分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10體積10%的氯化鈣溶液，使DNA與RNA均成為鈣鹽后塞淹，再利用DNA鈣鹽在2/10體積乙醇中能形成沉淀析出窟蓝，RNA鈣鹽不形成沉淀而彼此分離。③活性炭吸附：將處理好的活性炭按1/15～1/20體積加入每毫升含有0饱普。5～1mgDNA溶液中运挫，0～4。C下攪拌1h 费彼，以31000×g離心1h滑臊，除去RNA后的DNA回收率可達(dá)94%。 　　在RNA制品中除去DNA箍铲，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法雇卷。在沒有陰離子化合物存在下，以等體積90%苯酚水溶液反復(fù)抽提RNA颠猴，可以除去絕大部分DNA关划。此外，也可采用加入脫氧核糖核酸酶處理翘瓮，破壞DNA贮折，或參考上述DNA與RNA分離方法將DNA除去凡蚜。 　　
（4）同類核酸的分離：①RNA混合物的分離：經(jīng)過提取的初步純化的RNA制品中含有各類RNA和某些已降解的RNA混雜物对供。進(jìn)一步純化時(shí)羽峰，多應(yīng)用柱層析肺魁、梯度離心及逆流分溶等方法。例如tRNA與rRNA的分離用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后每庆，以不同梯度氯化鈉溶液洗脫筐带，或用蔗糖梯度（頂部5%濃度，底部20%濃度）離心法分開缤灵。mRNA的代謝速度較快伦籍，在細(xì)菌中平均壽命為90min，在哺乳動(dòng)物中約為幾小時(shí)至十幾小時(shí)腮出，常用密度梯度離心法和DNA-瓊脂柱進(jìn)行分離帖鸦。制備rRNA時(shí)，由于共沉作用胚嘲，匙鞫混有mRNA，一般可用萘-1慢逾，5-二磺酸處理立倍，使二者分開。各種tRNA的提純侣滩，通常采用逆流分溶法在磷酸緩沖液-甲酰胺-異丙醇系統(tǒng)下進(jìn)行口注，分離效果較好。②DNA混合物的分離：主要是變性或降解的DNA和天然的分離君珠，常用磷酸鈣寝志、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析策添，逆流分溶材部，梯度離心等方法。一個(gè)具有生物活性高度提純的DNA制品應(yīng)具有如下標(biāo)準(zhǔn)：不含有蛋白質(zhì)及多糖唯竹；不含有可透析的小分子雜物乐导；在pH7時(shí)紫外吸收最大值在257～261μm之間，E（P）在6600左右浸颓；不含有RNA物臂；固體為纖維狀，水溶液具有高的粘度并有流動(dòng)雙折射作用产上；具有電泳均一性及超離心中單分散性棵磷；具有生物活性。

參考：來自白昌明科學(xué)網(wǎng)博客晋涣。
鏈接地址：</label>http://blog.sciencenet.cn/blog-117857-683185.html