實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞的復(fù)蘇
一漩氨、目的：
掌握將凍存良好的細(xì)胞復(fù)蘇膛腐、培養(yǎng)的基本原理與方法。
二执解、原理：
細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作寞肖，可以解決細(xì)胞因?yàn)檫B續(xù)繼代造成的退變或轉(zhuǎn)化。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融衰腌，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力新蟆。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化右蕊，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷琼稻。
三、步驟：
（一）材料準(zhǔn)備：
儀器：凈化工作臺(tái)饶囚、 離心機(jī)帕翻、恒溫水浴箱、冰箱（4℃萝风、-20℃嘀掸、-80℃）、倒置顯微鏡规惰、培養(yǎng)箱睬塌、微量加樣器。
耗材：槍頭歇万、 培養(yǎng)皿揩晴、15ml離心管、酒精燈贪磺、廢液缸硫兰。
試劑：培養(yǎng)基、血清寒锚、雙抗（青霉素瞄崇、鏈霉素）。
其他物品：記號(hào)筆壕曼、橡膠手套苏研、口罩、100%和75%酒精腮郊。
（二）細(xì)胞復(fù)蘇步驟：
1.從液氮或-80℃冰箱容器中取出凍存管摹蘑，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化轧飞。
2.從37℃水浴中取出凍存管衅鹿，于超凈臺(tái)中打開(kāi)蓋子撒踪，用槍頭吸出細(xì)胞懸液，加到15ml離心管中（離心管中已預(yù)先加入了3ml細(xì)胞完全培養(yǎng)基）大渤，輕彈混勻制妄。
3.離心， 1 000 rpm泵三，5 min耕捞。
4.棄去上清液，輕輕敲打重懸細(xì)胞烫幕，加入含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基俺抽，輕彈重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度较曼，接種培養(yǎng)皿磷斧，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5.次日更換一次培養(yǎng)液捷犹，繼續(xù)培養(yǎng)弛饭。
4、 注意事項(xiàng)：
1．拿出凍存的細(xì)胞后萍歉，盡快置于37℃水浴中融化孩哑，整個(gè)復(fù)蘇過(guò)程要快；
2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)翠桦，要做好防護(hù)工作，以免凍傷胳蛮；
3．細(xì)胞輕彈混勻销凑，勿反復(fù)多次吹打。
實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞的傳代
一仅炊、目的：
學(xué)習(xí)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理及一般方法斗幼，熟悉傳代培養(yǎng)的操作步驟以及進(jìn)一步掌握無(wú)菌操作技術(shù)。
二抚垄、原理：
體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代蜕窿，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)呆馁。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后桐经，由于密度過(guò)大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散浙滤，從容器中取出阴挣，以1:2 或l:3 以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)纺腊。
細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)期畔咧。在一代中茎芭，細(xì)胞培增3～6 次。細(xì)胞傳代后誓沸，一般經(jīng)過(guò)三個(gè)階段：游離期梅桩、指數(shù)增生期和停止期。常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度拜隧，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)／100 個(gè)細(xì)胞宿百。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％虹蓄。
細(xì)胞接種2～3 天分裂增殖旺盛犀呼，是活力最好時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)薇组，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)外臂。
三、步驟：
（一）材料準(zhǔn)備：
生長(zhǎng)良好的細(xì)胞律胀，密度約為90%
儀器：凈化工作臺(tái)宋光、 離心機(jī)、恒溫水浴箱炭菌、冰箱（4℃罪佳、-20℃）、倒置顯微鏡黑低、培養(yǎng)箱赘艳、微量加樣器。
耗材：槍頭克握、 培養(yǎng)皿蕾管、15ml離心管、酒精燈菩暗、廢液缸掰曾。
試劑：培養(yǎng)基、血清停团、雙抗（青霉素旷坦、鏈霉素）、胰蛋白酶佑稠、1×PBS秒梅。
其他物品：記號(hào)筆、記號(hào)筆舌胶、橡膠手套番电、口罩、100%和75%酒精。
（二）細(xì)胞傳代步驟：
1.將長(zhǎng)成單層的細(xì)胞培養(yǎng)皿（60mm）從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出漱办，在超凈工作臺(tái)中这刷，吸出瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基。
加入1×PBS 2ml娩井，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以清洗細(xì)胞暇屋，吸出棄去1×PBS。
加入胰蛋白酶0.5ml洞辣，靜置3-5 分鐘咐刨。
靜置期間，在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞扬霜，如果細(xì)胞變圓定鸟，相互之間不再連接成片，這時(shí)應(yīng)立即在超凈臺(tái)中著瓶，加入2倍體積完全培養(yǎng)基（含血清）联予，本次加入1ml 完全培養(yǎng)液，吹打材原，制成細(xì)胞懸液沸久。
5.將細(xì)胞懸液吸出置于15ml離心管，1 000 rpm余蟹，離心5 min卷胯。
棄去消化液，輕敲離心管底威酒，使細(xì)胞初步重懸窑睁。
加入1.5ml完全培養(yǎng)基于細(xì)胞中，吹打混勻細(xì)胞葵孤。
取出另外兩個(gè)新的60mm培養(yǎng)皿担钮，每個(gè)加入2.5ml完全培養(yǎng)基，原消化皿中也加入2.5ml完全培養(yǎng)基佛呻，并做標(biāo)記。
將離心管中的細(xì)胞懸液0.5ml/皿病线，梅花式分別滴入三個(gè)培養(yǎng)皿中吓著。
10.用槍頭吹打細(xì)胞若干次，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)送挑。
一般情況绑莺，傳代后的細(xì)胞在4-6 小時(shí)左右就能貼壁，2～4 天就可在瓶?jī)?nèi)形成單層惕耕，需要再次進(jìn)行傳代纺裁。
5、 注意事項(xiàng)：
加入1×PBS時(shí)盡量貼壁加，不要直接對(duì)著細(xì)胞欺缘，以免將細(xì)胞吹開(kāi)栋豫，大片脫落；
培養(yǎng)基及1×PBS實(shí)驗(yàn)前37℃水浴箱預(yù)熱谚殊；
操作過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作丧鸯；
加入胰酶后，可以輕敲培養(yǎng)皿嫩絮，觀察細(xì)胞呈流沙狀即為消化完成丛肢。
實(shí)驗(yàn)三：細(xì)胞的凍存
一、目的：
學(xué)習(xí)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理及一般方法剿干，熟悉傳代培養(yǎng)的操作步驟以及進(jìn)一步掌握無(wú)菌操作技術(shù)蜂怎。
二、原理：
細(xì)胞凍存是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境置尔，減少細(xì)胞代謝杠步，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)，起到了細(xì)胞保種作用撰洗。另外篮愉，為了防止因污染或技術(shù)原因使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而會(huì)出現(xiàn)變異差导，有時(shí)因寄贈(zèng)试躏、交換和購(gòu)買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室设褐，均需對(duì)進(jìn)行低溫保存颠蕴。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。
細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時(shí)助析，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止犀被，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存外冀。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵寡键，在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程。在此溫度范圍內(nèi)雪隧，水晶呈針狀西轩，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜作保護(hù)劑脑沿，它是一種滲透性保護(hù)劑藕畔，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性庄拇，降低冰點(diǎn)注服，延緩凍結(jié)過(guò)程韭邓，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶溶弟，減少胞內(nèi)冰晶女淑，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
三可很、步驟：
（一）材料準(zhǔn)備：
生長(zhǎng)良好的細(xì)胞诗力，密度約為90%
儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)我抠、恒溫水浴箱苇本、冰箱（4℃、-20℃菜拓、-80℃）瓣窄、倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱纳鼎、微量加樣器俺夕、液氮罐。
耗材：槍頭贱鄙、 培養(yǎng)皿劝贸、15ml離心管、凍存管逗宁、酒精燈映九、廢液缸、液氮瞎颗。
試劑：培養(yǎng)基件甥、血清、雙抗（青霉素哼拔、鏈霉素）引有、胰蛋白酶、1×PBS倦逐、二甲基亞砜（DMSO）譬正。
其他物品：記號(hào)筆、記號(hào)筆檬姥、橡膠手套曾我、口罩、100%和75%酒精穿铆。
（二）細(xì)胞傳代步驟：
（一）細(xì)胞凍存
配制含10%DMSO您单、20%血清斋荞、70%培養(yǎng)基的凍存培養(yǎng)液荞雏。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗凤优。
去除PBS悦陋，加入適量胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化好后筑辨，加入2倍體積完全培養(yǎng)基俺驶，吹打，懸起細(xì)胞棍辕。
離心1000rpm暮现，5min；
去除胰蛋白酶楚昭，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液栖袋，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為1×106/ml ~ 5 ×106/ml抚太；
將細(xì)胞分裝入凍存管中塘幅，每管1～1.5 ml；
在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱尿贫，凍存時(shí)間及操作者电媳，包好棉花，或直接放入凍存盒庆亡，置于-80℃過(guò)夜匾乓，若采用凍存盒則忽略8中的降溫步驟。
如采用棉花包裹身冀，凍存方法：4℃钝尸，30min；-20℃搂根，30min珍促； -80℃，過(guò)夜剩愧，次日早晨猪叙，轉(zhuǎn)移浸入液氮中。
6仁卷、 注意事項(xiàng)：
欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)穴翩，約為80～90%致密度；
細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存無(wú)限時(shí)間锦积，而不會(huì)影響細(xì)胞活力芒帕，在-80度可保存數(shù)月；
注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)丰介。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)背蟆，無(wú)菌且無(wú)色鉴分，避光保存；
一定注意緩慢降溫時(shí)間带膀。
實(shí)驗(yàn)四 轉(zhuǎn)染
（1） 胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)志珍，接種至100mm培養(yǎng)皿中，使其在轉(zhuǎn)染日密度為60%-70垛叨。底面積為100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,每個(gè)皿內(nèi)最大容量加入24.0μg質(zhì)粒DNA伦糯，用1.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋,混合在室溫下放置5 min。
(1) 使用1.5ml無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋80μl LIPOFECTAMINE 2000試劑嗽元。在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合敛纲。
(2) 混合稀釋的質(zhì)粒DNA和稀釋的LIPOFECTAMINE 2000，室溫靜置20分鐘剂癌。
(3) 然后將上述混合物均勻的加入到細(xì)胞中载慈。
(4) 在37℃，5％CO2珍手，100%飽和濕度中保溫6小時(shí)办铡，每個(gè)培養(yǎng)皿各加入12ml新鮮含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)琳要。24小時(shí)后用新鮮含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液替換原先的舊培養(yǎng)基寡具，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后可提RNA稚补，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后可提蛋白和RNA童叠。
293T細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染Protocol
