從新生大鼠的骨骼肌中分離成肌細(xì)胞（衛(wèi)星細(xì)胞）烹俗，在體外培養(yǎng)條件下爆侣，成肌細(xì)胞在培養(yǎng)底物上增殖，在誘導(dǎo)分化條件下幢妄，可遷移成直線排列兔仰，最終融合形成多細(xì)胞肌管。已有報(bào)道蕉鸳，將自體的骨骼肌細(xì)胞移植入心肌梗死后的瘢痕可改善心
肌功能乎赴。這些進(jìn)展激發(fā)了科研人員對(duì)體外成肌細(xì)胞增殖、分化分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究潮尝。下面將介紹新生大鼠骨骼肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及肌管誘導(dǎo)分化榕吼。該方法也可用于小鼠、兔勉失、豬或狗等動(dòng)物骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)羹蚣。
（ 一）材料與設(shè)備
1. 動(dòng)物Wistar 新生大鼠（出生24~48h) 。
2. 試劑
（1） MEM-EBSS 培養(yǎng)液乱凿，進(jìn)口優(yōu)質(zhì)胎牛血清( FBS), L－谷氨酰胺2mmol/L ,雙抗試液（青霉素100U/ml顽素、鏈霉素100μg/ml ) ，丙酮酸鈉1mmol/L 告匠， II 型膠原酶戈抄，D-Hanks 溶液， 0.25％胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液后专，馬血清( HS) 划鸽。
（2）增殖培養(yǎng)液的配制： MEM-EBSS+15%~20% FBS＋雙抗試液＋L-谷氨酰胺＋丙酮酸鈉。
（3）分化培養(yǎng)液的配制： MEM-EBSS+2%FBS+10%HS＋雙抗試液＋L-谷氨酰胺＋丙酮酸鈉戚哎。
3. 設(shè)備
手術(shù)器械裸诽，細(xì)胞篩(100 目、200 目型凳、400 目）丈冬，離心機(jī)， CO2培養(yǎng)箱甘畅， T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶埂蕊，細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑60mm), 24 孔板。
（ 二） 操作步驟
1. 取24~48h 新生大鼠胸大肌及股四頭肌疏唾，用眼科剪將其剪成1mm3大小肉糜蓄氧， 以D-Hanks 溶液沖洗2~3 次。
2. 以0.17％的胰蛋白酶和0.085％的 II 型膠原酶同時(shí)消化50~60min, 其間每10min 吹打1 次槐脏。
3. 離心（每分鐘1000 轉(zhuǎn)喉童，10min) ，棄去上清液顿天， 加入無(wú)血清的MEMEBSS培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中用20ml 注射器抽吸堂氯、吹打約10 次蔑担，以釋放骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。
4 . 分別過(guò)100 目咽白、200 目啤握、400 目細(xì)胞篩網(wǎng)。
5. 收集細(xì)胞懸液于未經(jīng)包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中局扶， 37 °C 靜置45 ~60min, 通過(guò)差速貼壁法恨统，去除大部分成纖維細(xì)胞。
6. 收集未貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)三妈，以每分鐘1500 轉(zhuǎn)的速率離心7min, 棄去上清液畜埋。
7. 以含15%~20%FBS 的MEM 增殖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 在24 孔板中畴蒲，以每孔4x 105~6x 105個(gè)/ml 接種細(xì)胞悠鞍。注意，接種密度可根據(jù)實(shí)際需求確定模燥，每孔最少不應(yīng)低于1.5 x I05個(gè)／ml咖祭； 接種密度與更換分化培養(yǎng)液的時(shí)間有關(guān)， 接種密度越高蔫骂， 更換分化培養(yǎng)液的間隔時(shí)間越短么翰，反之亦然。
8 . 細(xì)胞貼壁并增殖20~36h （根據(jù)接種密度決定）辽旋，待細(xì)胞至60%~70％匯合時(shí)浩嫌，可更換含2 % FBS 和10 %HS 的MEM 分化培養(yǎng)液，之后每24~48h更換1 次分化培養(yǎng)液 补胚。
9. 每孔以1.5x 105個(gè)/ml 的密度接種码耐，可于3~4d 時(shí)出現(xiàn)肌管。注意溶其，接種密度可影響肌管形成的時(shí)間及形態(tài)骚腥，接種密度越高，肌管形成越早瓶逃，肌管數(shù)量越多束铭，肌管越粗大。
（三）細(xì)胞鑒定
肌絲蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性厢绝。
（四）小結(jié)
組織以酶消化后纯露，輕微機(jī)械研磨使肌纖維分離，釋放出成肌細(xì)胞代芜。不加誘導(dǎo)分化條件，體外可傳代4 次浓利。
