作者载绿,Evil Genius
10X推出了下一代的單細胞技術(shù)粥诫,重新采用了最開始的雙通道單細胞捕獲方案。
我18年開始做單細胞卢鹦,20年開始做空轉(zhuǎn)臀脏,當(dāng)然劝堪,95%的項目是10X的冀自,科研方向10X技術(shù)也是大量的產(chǎn)出文章,但更讓我佩服的是10X技術(shù)的更新秒啦,每年都會推出新產(chǎn)品或者技術(shù)迭代熬粗,這是一個正向的循環(huán),再加上我這樣不斷利用10X的技術(shù)平臺做分析并且不斷推進生信分析質(zhì)量的人余境,這個生態(tài)短時間無法打破驻呐。
國內(nèi)起步晚,自然就是一步跟不上芳来,步步都費勁含末,像墨卓、華大等公司專注于平臺即舌,生信分析幾乎不做的情況下佣盒,產(chǎn)品更新的速度也是慢的離譜。
10X更新的速度幾乎可以用卷來形容顽聂,主要生態(tài)鏈好肥惭。
新版10X單細胞技術(shù)GEM-X改善的地方匯總
1盯仪、檢測到的基因增加了兩倍,并改善了對稀有轉(zhuǎn)錄本蜜葱、脆弱細胞和低RNA含量細胞的捕獲全景,從而提高了靈敏度
2、更高的吞吐量牵囤,每個通道捕獲的細胞增加了兩倍(每個通道最多20,000個細胞)
3爸黄、更具成本效益,每個細胞和樣品的成本降低50%以上
4揭鳞、提高樣品回收率-高達80%的細胞回收率
5馆纳、增強的數(shù)據(jù)質(zhì)量和魯棒性,部分原因是多細胞率減半(每1000個細胞0.4%)和更有效的GEM生成而不增加細胞應(yīng)激
6汹桦、更快的運行時間——在6分鐘內(nèi)對數(shù)萬個細胞進行標(biāo)記
其中關(guān)鍵的地方
- 可以有效檢出中性粒細胞
- 減少了平臺對細胞的應(yīng)激反應(yīng)鲁驶,更加真實的捕獲細胞的表達狀態(tài)
- 多細胞率生成的比率下降
- VDJ檢出率上升
- 檢出的基因數(shù)大大增加
如今,單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種成熟可靠的方法舞骆,使研究人員能夠深入研究由細胞異質(zhì)性驅(qū)動的生物復(fù)雜性钥弯。使用scRNA-seq技術(shù)的科學(xué)家已經(jīng)取得了令人難以置信的發(fā)現(xiàn)。
2009年scRNA-seq的出現(xiàn)督禽,就像美國宇航局在20世紀(jì)90年代發(fā)射哈勃太空望遠鏡一樣脆霎,讓我們對一個被低估的宇宙有了前所未有的認(rèn)識。從那時起狈惫,從植物生物學(xué)到藥物毒性的所有研究都采用了scRNA-seq睛蛛。但是,快速和廣泛地采用新興方法需要技術(shù)改進胧谈,以建立新的特征和能力忆肾,并適應(yīng)日益復(fù)雜的研究目標(biāo)。
最終菱肖,太空探索需要比哈勃望遠鏡更強大的發(fā)現(xiàn)能力客冈,這導(dǎo)致了詹姆斯·韋伯望遠鏡的發(fā)展,這使得科學(xué)家們能夠以前所未有的分辨率看到新星的誕生稳强。同樣场仲,單細胞探索已經(jīng)超出了哈勃望遠鏡的能力,需要更強大的工具來推動研究向前發(fā)展退疫。
10X新的先進的GEM-X技術(shù)為擴展創(chuàng)新和應(yīng)用支持提供了堅實的基礎(chǔ)渠缕,迎來了下一代單細胞技術(shù)。隨著試劑和微流控芯片架構(gòu)的優(yōu)化褒繁,單細胞基因表達(3 ')和單細胞免疫分析(5 ')解決方案現(xiàn)在更敏感亦鳞,更強大,并提供更高的通量,從而在生物學(xué)的各個方面提供更強大的見解蚜迅。
這項新技術(shù)改進了基礎(chǔ)化學(xué)舵匾,為單細胞結(jié)果提供了動力。scRNA-seq的應(yīng)用已經(jīng)在發(fā)育生物學(xué)谁不、癌癥研究和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域變得如此廣泛坐梯。
How does 10x Genomics scRNA-seq work?
由Next GEM技術(shù)驅(qū)動的單細胞基因表達和單細胞免疫分析檢測的基礎(chǔ)化學(xué)原理在GEM-X檢測中保持不變——它與哈佛大學(xué)研究人員于2015年發(fā)表的基礎(chǔ)Drop-seq方法有關(guān)。
像大多數(shù)偉大的科學(xué)一樣刹帕,這個過程始于研究人員將幾微升看似相同的透明液體移液到一個帶有油的微流控芯片中吵血,形成反應(yīng)容器,稱為乳狀凝膠珠(GEMs)偷溺。
但是這些透明的液體并不完全相同蹋辅。該混合物由帶有裂解緩沖液的細胞懸濁液,涂有少核苷酸的凝膠珠組成挫掏,其中包括一個10X條形碼侦另,標(biāo)記每個RNA分子的起源細胞和一個獨特的分子標(biāo)識符(UMI),為每個轉(zhuǎn)錄物提供一個獨特的fingerprint尉共,一個用于捕獲3 '或5 '端mRNA的poly(dT)序列褒傅,以及用于下游下一代測序的adapter sequences。
一旦芯片被放置在Chromium X系列儀器中袄友,細胞就會以有限的稀釋度通過微流體來產(chǎn)生GEMs殿托,這些GEMs看起來像納米大小的Gel Bead,每個Gel Bead包含一個細胞剧蚣。細胞被裂解支竹,凝膠珠溶解。釋放的RNA的3 '端與包裹凝膠珠的poly-dT序列結(jié)合鸠按。引物RNA逆轉(zhuǎn)錄礼搁,形成互補DNA (cDNA)。
來自單個細胞的所有cDNA待诅,源自單個Gel Bead叹坦,將具有相同的10X條形碼熊镣,能夠?qū)⒚總€轉(zhuǎn)錄本映射回其起源細胞卑雁。然而,單個凝膠珠上的單個寡核苷酸具有不同的UMIs绪囱,這使得每個cDNA分子具有獨特的隨機12堿基序列测蹲。這允許在下游處理過程中消除任何PCR重復(fù)。
然后將條形碼cDNA用于制備測序文庫鬼吵,其中包括sequencing adapters的添加和PCR擴增扣甲。最后,用NGS對文庫進行測序。
單細胞免疫分析試驗利用引物靶向mRNA的5 '端琉挖,工作原理略有不同启泣。
What are the benefits of conducting scRNA-seq analysis with the proven, instrument-supported Chromium workflow?
Chromium平臺標(biāo)準(zhǔn)化了scRNA-seq工作流程,使每個研究人員都可以獲得可靠示辈,可重復(fù)和有影響力的單細胞見解寥茫,無論他們的技能水平或?qū)I(yè)知識如何。
無數(shù)研究領(lǐng)域的科學(xué)家矾麻,從神經(jīng)科學(xué)到免疫學(xué)再到藥物開發(fā)纱耻,都使用了10X單細胞基因表達(3 ')和單細胞免疫譜(5 ')分析,取得了令人難以置信的發(fā)現(xiàn)险耀,超過6500篇發(fā)表的研究證明了這一點弄喘,其中包括近700篇發(fā)表在《自然》、《科學(xué)》和《細胞》上的論文甩牺。
10X技術(shù)創(chuàng)新的一個關(guān)鍵方面是10X的儀器蘑志。
雖然所有的單細胞工作流程都需要儀器,如PCR儀和測序儀贬派,自動化分割和條形碼步驟限制了人工工作流程帶來的技術(shù)錯誤或批處理效果的可能性卖漫,因為手工工作流程需要大量的動手時間和移液步驟。擁有不同技能的不同研究人員(甚至跨越多個機構(gòu))可以使用一個強大的平臺進行相同的實驗赠群,幫助獲得相同的結(jié)果羊始。
How does GEM-X improve upon the tried-and-tested Chromium scRNA-seq workflow?
通過GEM-X,通過優(yōu)化的試劑查描,改進的微流體和升級的分析軟件改進了久經(jīng)考驗的scRNA-seq工作流程的每一步突委,這些軟件由最先進的單細胞儀器-Chromium X系列支持。
重新設(shè)計了GEM-X微流控芯片架構(gòu)冬三,設(shè)置匀油,壓力,分區(qū)大小等勾笆,以提高單細胞基因表達(3 ')和單細胞免疫分析(5 ')分析的整體性能敌蚜,與以前的版本相比,包括最小的堵塞和最大的細胞大小靈活性窝爪。這種重新設(shè)計改進了單細胞工作流程中的關(guān)鍵步驟弛车,包括GEM生成和細胞劃分。
While our Next GEM microfluidic chips require step emulsification—whereby GEMs are generated independently of partitioning oil—GEM-X microfluidic chips utilize the flow of partitioning oil to facilitate GEM formation. Twice as many GEMs are generated at smaller volumes, reducing multiplet rates two-fold and increasing throughput capabilities.
GEM-X微流控芯片還可以實現(xiàn)更快蒲每,更強大的細胞分配纷跛。6分鐘運行時間對細胞應(yīng)激沒有負(fù)面影響,因為細胞可以快速通過GEM-X芯片邀杏,從而保留脆弱的細胞類型贫奠。
但這些技術(shù)升級對研究意味著什么?全面提高性能。
How can high-performance scRNA-seq, powered by GEM-X, bolster my research?
先進的GEM-X技術(shù)為下一代單細胞基因表達(3 ' v4)和單細胞免疫分析(5 ' v3)解決方案提供動力,這不僅是10多年構(gòu)建微流控芯片和開發(fā)行業(yè)領(lǐng)先的單細胞檢測經(jīng)驗的高潮唤崭,也是客戶反饋的直接結(jié)果拷恨。這是一款為客戶打造的產(chǎn)品,其目標(biāo)是能夠?qū)⒀芯客葡蛐碌母叨取?/h4>
在深入研究數(shù)據(jù)之前谢肾,強調(diào)一下GEM- X與Next GEM技術(shù)相比的主要優(yōu)勢:
- Increased sensitivity enabled by a two-fold increase in detected genes and improved capture of rare transcripts, fragile cells, and cells with low RNA content
- Higher throughput with a two-fold increase in cells captured per channel (up to 20,000 cells per channel)
- More cost effective with a more than 50% reduction in cost per cell and sample
Improved sample recovery—up to 80% cell recovery efficiency
- Enhanced data quality and robustness due, in part, to a halved multiplet rate (0.4% per 1,000 cells) and more efficient GEM generation with no increase in cell stress
- Faster run times—tens of thousands of cells are partitioned and barcoded in just 6 minutes
Why do improved gene sensitivity and cell recovery matter?
scRNA-seq使研究人員能夠揭示稀有轉(zhuǎn)錄本挑随、細胞狀態(tài)和細胞群,其他方法勒叠,如bulk RNA-seq兜挨、流式細胞術(shù)和質(zhì)譜法,無法檢測到眯分。有了單細胞分辨率拌汇,研究人員可以發(fā)現(xiàn)他們以前不知道要尋找的新生物學(xué)。
但是弊决,要想獲得隱藏在樣本復(fù)雜性中的關(guān)鍵見解噪舀,需要既能捕獲這些罕見細胞,又能靈敏地檢測到它們所擁有的低表達轉(zhuǎn)錄本的方法飘诗。
在分析復(fù)雜小鼠腦樣品細胞核的并排實驗中与倡,新技術(shù)多檢測到98%的基因和249%的細胞轉(zhuǎn)錄本。Chromium GEM- X單細胞免疫分析v3也比其Next GEM(v2)更敏感昆稿,GEM- X對人外周血單個核細胞(PBMCs)進行并排分析纺座,檢測到的基因多61%,轉(zhuǎn)錄本多103%溉潭。
這對你的研究意味著什么?隨著靈敏度的提高净响,研究人員可以檢測到短時間瞬態(tài)的細胞,從而在分化過程中獲得關(guān)鍵的見解喳瓣。當(dāng)細胞從一種細胞分化為另一種細胞時馋贤,基因被迅速而動態(tài)地調(diào)節(jié),使細胞向前移動到下一個穩(wěn)定的細胞狀態(tài)畏陕,就像從神經(jīng)祖細胞到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變一樣配乓。細胞表面標(biāo)記并不總是在一種細胞類型與另一種細胞類型之間發(fā)生顯著變化,這使得流式細胞術(shù)等常用技術(shù)無法檢測到這些短暫狀態(tài)惠毁。
然而犹芹,利用高度敏感的單核或單細胞RNA-seq,研究人員可以分析活躍分化細胞樣本中單個細胞的轉(zhuǎn)錄物水平仁讨,從而為研究人員提供解析瞬時細胞狀態(tài)所需的分辨率羽莺。識別這些短暫的轉(zhuǎn)變可以幫助我們提高對發(fā)育生物學(xué)、衰老的理解洞豁,并確定最有效的細胞群進行細胞治療。
如果研究人員從樣本中捕獲更多的細胞,也有更好的機會識別這些關(guān)鍵但稀疏的細胞狀態(tài)丈挟。新技術(shù)更好地捕獲了珍貴樣品中的細胞刁卜。包括通常產(chǎn)生很少細胞的樣本,如組織活檢或先前的流式分選細胞曙咽。
例如蛔趴,單細胞技術(shù)通過對患者腫瘤樣本的分析,幫助科學(xué)家打破腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性——描繪驅(qū)動轉(zhuǎn)移的機制例朱、藥物療效和副作用孝情。更強大的單細胞工具可以增強對患者異質(zhì)腫瘤樣本中罕見細胞群的發(fā)現(xiàn),從而能夠識別藥物療效洒嗤、治療耐藥性和毒性的機制箫荡,最終為更有效的患者分層提供信息。
10x研究人員通過分析人類腎細胞癌樣本中分離的腫瘤細胞渔隶,證明了Chromium GEM-X單細胞免疫譜(5 ')v3對臨床樣本的強大分析能力羔挡。GEM- X檢測腎細胞癌的四種關(guān)鍵標(biāo)志物的水平均高于Chromium Next GEM單細胞免疫譜(5 ')v2。
How can cost-effective scRNA-seq solutions with higher throughput boost your study’s impact?
Chromium GEM-X單細胞基因表達(3 ')v4和Chromium GEM-X單細胞免疫分析(5 ')v3檢測通過實現(xiàn)更高的通量和更具成本效益的分析间唉,進一步保護寶貴的樣品绞灼。與Next GEM-powered assay、Chromium GEM-X單細胞基因表達(3 ')v3.1和Chromium GEM-X單細胞免疫譜分析(5 ')v2相比呈野,現(xiàn)在可以運行20,000個細胞低矮,每個細胞的成本下降超過一半,多細胞形成率降低2倍被冒。
改進的細胞捕獲率商佛、低的多細胞形成率和更高的通量增加了捕獲對基本過程或治療效果和耐藥性至關(guān)重要的稀有細胞群的可能性。事實上姆打,2020年對單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)出版物的調(diào)查表明良姆,鑒定的細胞類型數(shù)量與研究的細胞數(shù)量密切相關(guān)。
然而幔戏,擴大研究規(guī)模不僅可以實現(xiàn)高度穩(wěn)健的分析玛追。包括更多的樣本可以提高你的研究的統(tǒng)計能力,使它更有洞察力和可靠性闲延。
但將研究規(guī)模擴大到數(shù)十萬甚至數(shù)百萬個細胞的成本可能過高痊剖。
這就是為什么10X致力于通過降低每個細胞和樣品的成本使單細胞分析更容易獲得。由于資源限制垒玲,許多人使用單細胞來驗證他們的bulk rna測序結(jié)果陆馁。但有了更高通量、更具成本效益的scRNA-seq合愈,研究人員不必限制他們的研究或他們的科學(xué)影響叮贩。他們獲得了一個大的數(shù)據(jù)集來挖掘或在未來返回來回答新的問題或推動其他科學(xué)研究击狮。
What cells have you been missing? How does GEM-X help you detect fragile, low RNA–content cells?
GEM-X增加了對脆弱、低RNA含量細胞的檢測益老,擴大了發(fā)現(xiàn)潛力彪蓬。由于細胞在GEM-X微流控芯片中的通道中移動得更快,脆弱的細胞在懸浮中的時間更短捺萌,可以被保存下來;高靈敏度確保檢測到低RNA含量的細胞档冬。
捕獲這些細胞增加了原先技術(shù)無法捕獲的細胞類型的機會。
眾所周知桃纯,中性粒細胞由于其脆弱的性質(zhì)酷誓、低RNA含量以及中性粒細胞顆粒中可能存在的干擾蛋白酶和核酸酶(這是使所有粒細胞難以捕獲的一個因素)而難以捕獲,因此很難進行scRNA-seq分析态坦。在10x和其他人已經(jīng)對現(xiàn)有的scRNA-seq協(xié)議和數(shù)據(jù)分析策略進行了修改盐数,以增加檢測到的中性粒細胞的數(shù)量。但捕捉這些finicky cells的細胞在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性驮配。
Chromium GEM-X單細胞基因表達(v4)消除了這一技術(shù)挑戰(zhàn)娘扩,并能夠通過標(biāo)準(zhǔn)工作流程有效地捕獲中性粒細胞。當(dāng)10x研究人員比較用Chromium GEM-X單細胞基因表達(v4)和單細胞基因表達(v3.1)對新鮮人白細胞進行scRNA-seq分析時壮锻,他們檢測到中性粒細胞的比例要大得多琐旁。
Next GEM(3’v3.1)和GEM- X(3’v4)檢測捕獲了所有預(yù)期的主要細胞類型群,包括幾種t細胞群猜绣、B細胞和血小板灰殴。乍一看,使用GEM-X單細胞基因表達v4測定法進行白細胞分析的數(shù)據(jù)看起來有些偏差掰邢。但這主要是由于檢測到的中性粒細胞數(shù)量大量增加牺陶。
除了中性粒細胞外,兩種化學(xué)物質(zhì)捕獲的每種主要免疫細胞類型的細胞數(shù)量相似辣之。采用Chromium GEM- X單細胞基因表達v4檢測法檢測到的中性粒細胞數(shù)量是Next GEM技術(shù)v3.1檢測法的近四倍掰伸。
由于中性粒細胞是血液中最豐富的細胞類型,這為與血液和免疫反應(yīng)的各個方面相關(guān)的令人興奮的新發(fā)現(xiàn)打開了大門怀估,使人們對感染的免疫反應(yīng)狮鸭、疫苗開發(fā)、自身免疫性疾病的機制和藥物途徑有了新的認(rèn)識多搀。
How can immune profiling assays benefit from GEM-X performance improvements?
捕獲中性粒細胞并不是GEM-X增強免疫學(xué)研究的唯一途徑歧蕉,Chromium GEM-X單細胞免疫分析分析的改進將幫助研究人員更好地理解驅(qū)動免疫功能的復(fù)雜機制。
使用Chromium GEM-X單細胞免疫分析(5 ')v3康铭,該檢測的一個關(guān)鍵特征是對配對B細胞或T細胞受體(BCR或TCR)的全長V(D)J序列的免疫細胞庫進行全面分析惯退。平均V-J配對率為95%,而10X單細胞免疫圖譜(5 ')v2的配對率為84%从藤。研究小組還觀察到T細胞受體基因TRA和TRB的檢測表達分別增加了200%和120%催跪。
增強BCR和TCR的表征將有助于最大限度地了解B細胞和T細胞在健康锁蠕、疾病、藥物和疫苗免疫反應(yīng)中的功能叠荠。這一點尤其重要匿沛,因為要從當(dāng)前的COVID-19大流行中吸取教訓(xùn)扫责,提高應(yīng)對未來新發(fā)疾病暴發(fā)的能力榛鼎。
生活很好,有你更好
- Increased sensitivity enabled by a two-fold increase in detected genes and improved capture of rare transcripts, fragile cells, and cells with low RNA content
- Higher throughput with a two-fold increase in cells captured per channel (up to 20,000 cells per channel)
- More cost effective with a more than 50% reduction in cost per cell and sample
Improved sample recovery—up to 80% cell recovery efficiency - Enhanced data quality and robustness due, in part, to a halved multiplet rate (0.4% per 1,000 cells) and more efficient GEM generation with no increase in cell stress
- Faster run times—tens of thousands of cells are partitioned and barcoded in just 6 minutes