單細(xì)胞測(cè)序方法和原理系列：
- 1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)原理：SMART蒙揣、TargetAmp和10X genomics
- 2. DNA文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序化學(xué)原理
- 3. 單細(xì)胞免疫組庫(kù)：TCR基因重排原理和TCR測(cè)序建庫(kù)方法
- 4. 單細(xì)胞ATAC-seq原理介紹與報(bào)告解讀
- 5. CITE-seq：同時(shí)測(cè)細(xì)胞表面蛋白和RNA的單細(xì)胞測(cè)序
- 6. LIBRA-seq：快速開發(fā)單克隆抗體的單細(xì)胞技術(shù)
- 7. 液滴型單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的比較
- 8. CEL-Seq原理
- 9. 單細(xì)胞3'文庫(kù)和5'文庫(kù)的區(qū)別
1. 簡(jiǎn)介
CRISPR篩選是一種強(qiáng)大的方法丽啡，可以研究某些基因的定量表達(dá)如何影響復(fù)雜的細(xì)胞表型和進(jìn)程嫩挤。10x Genomics的Chromium單細(xì)胞CRISPR篩選解決方案角骤，使研究人員能夠以單細(xì)胞分辨率分析數(shù)百個(gè)不同的CRISPR擾動(dòng)陪白，并檢測(cè)與基因表達(dá)表型直接關(guān)聯(lián)的單鏈向?qū)NA(sgRNA)成畦。與批量CRISPR篩選或逐一敲除相比这揣，這種全面的方法讓研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)更高的通量、更高的實(shí)驗(yàn)效率和分辨率怀吻，從而探索遺傳擾動(dòng)的整體轉(zhuǎn)錄組影響瞬浓。
2. 原理
2.1：3'文庫(kù)原理
在設(shè)計(jì)sgRNA的時(shí)候，在sgRNA上面設(shè)計(jì)添加capture sequence序列蓬坡，這個(gè)序列能和10x Gel Beads上原有的capture seq序列互補(bǔ)猿棉。
這樣通過(guò)這種sgRNA轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞直接通過(guò)10x平臺(tái)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行捕獲，在小油滴的反應(yīng)體系中Gel Beads上的oligo序列在捕獲mRNA的同時(shí)也會(huì)捕獲細(xì)胞中的sgRNA序列屑咳，并且根據(jù)sgRNA上的protospacer序列知道是哪一種sgRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)了細(xì)胞萨赁，這樣就能在檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的同時(shí)檢測(cè)這個(gè)細(xì)胞受到哪種sgRNA的編輯以及編輯后基因表達(dá)的情況。
文庫(kù)：
參考：
Guide RNA Specifications Compatible with Feature Barcoding technology for CRISPR Screening
Chromium Next GEM Single Cell 3? Reagent Kits v3.1 (with Feature Barcoding technology for CRISPR Screening)
2.2：5'原理
在3' crispr篩選方案中杖爽，我們需要重新設(shè)計(jì)合成sgRNA。引入能被膠珠所捕獲的capture sequence（還需要經(jīng)過(guò)一定的篩選和優(yōu)化選擇的過(guò)程）。5' crispr篩選方案則大大簡(jiǎn)化了這一過(guò)程慰安。它可以直接使用市面上常用的sgRNA原始文庫(kù)（可以對(duì)比下面的左圖和上面3'的sgRNA）腋寨，也可以兼容設(shè)計(jì)好的3' sgRNA文庫(kù)。
參考：
Chromium Next GEM Single Cell 5' Reagent Kits v2 (Dual Index) with Feature Barcode technology for CRISPR Screening
Chromium Single Cell CRISPR Screening – Experimental Planning Guide
3. 其他注意點(diǎn)
- 所要篩選的sgRNA文庫(kù)大小和細(xì)胞數(shù)
> 每種sgRNA推薦覆蓋100-200個(gè)細(xì)胞（只有覆蓋了足夠多的細(xì)胞數(shù)化焕，cellranger分析時(shí)才能設(shè)置合適的UMI閾值來(lái)進(jìn)行sgRNA的分配以及差異基因表達(dá)分析）
> 每個(gè)基因推薦設(shè)置1-5個(gè)sgRNA
> 非靶標(biāo)sgRNA需要至少占到整個(gè)sgRNA文庫(kù)的10%以上（cellranger分析時(shí)必須包含非靶標(biāo)sgRNA才能進(jìn)行合適的差異表達(dá)分析）萄窜。
例如：有20個(gè)目的基因，每個(gè)基因設(shè)置2條sgRNA（共40條）撒桨，可以設(shè)置5條非靶標(biāo)sgRNA（共45條）查刻。因此至少需要獲得4500個(gè)細(xì)胞。
- 還需要考慮所采用的細(xì)胞類型
比如說(shuō)研究的目的基因表達(dá)量較低而所采用的細(xì)胞RNA含量較高（如腫瘤）元莫，為了觀測(cè)到目的基因的變化赖阻，我們就需要加大測(cè)序深度，測(cè)序成本就會(huì)提升踱蠢。這時(shí)就可以選擇RNA含量不是那么高的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)火欧。
4. 成功與10x結(jié)合的Cas9方法
5. 已有方法
單細(xì)胞CRISPR篩選方法包括Perturb-seq (GBC Perturb-seq)、CRISPR-seq茎截、CROP-seq等苇侵。類似于混合篩查，這些新方法使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在單個(gè)樣本中并行生成多達(dá)數(shù)千個(gè)遺傳擾動(dòng)企锌，但使用單細(xì)胞RNA-seq（single cell RNA-seq, scRNA-seq）作為讀數(shù)榆浓。該方法可以同時(shí)測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的擾動(dòng)和表型。這些新技術(shù)不依賴于特定表型或存活撕攒，表型被記錄為整個(gè)轉(zhuǎn)錄組陡鹃，為解析基因功能關(guān)系提供了大量數(shù)據(jù)《镀海基于plate的scRNA-seq平臺(tái)還可以為每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行附加測(cè)量萍鲸，如成像或FACS數(shù)據(jù)。所有這些新方法都成功地將豐富的表型信息與細(xì)胞平板中的每個(gè)特定擾動(dòng)相關(guān)聯(lián)擦俐，有助于實(shí)現(xiàn)大規(guī)募挂酰基因組功能篩查。
將CRISPR篩選融入scRNA-seq蚯瞧，在技術(shù)上并不容易嘿期。CRISPR驅(qū)動(dòng)的擾動(dòng)需要從RNA聚合酶III（Pol III）特異性U6啟動(dòng)子處，表達(dá)高水平的靶向特定基因的單向?qū)NA（single guide RNA, sgRNA）埋合。但是sgRNA缺少poly（A）尾端备徐，所以其身份不能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)scRNA-seq方法讀出。所有這三種方法通過(guò)產(chǎn)生攜帶pol III:sgRNA和Pol II驅(qū)動(dòng)的可選擇和/或熒光標(biāo)記的載體來(lái)解決這個(gè)讀出問(wèn)題甚颂，其中3'UTR含有sgRNA特異性序列坦喘。PERTURB-seq和CRISP-seq依賴于芯片克隆策略產(chǎn)生的RNA庫(kù)盲再，來(lái)將每個(gè)sgRNA鏈接到特定的擾動(dòng)條形碼轉(zhuǎn)錄物上西设。相比之下瓣铣，CROP-seq的克隆解決方案更為簡(jiǎn)單優(yōu)雅：將Pol III:sgRNA復(fù)合體整合到報(bào)告轉(zhuǎn)錄物中，并插入到慢病毒載體的長(zhǎng)重復(fù)序列末端中贷揽。這樣Pol III:sgRNA復(fù)合體在病毒整合期間會(huì)被復(fù)制棠笑。這種簡(jiǎn)化的克隆方法使得CROP-seq與現(xiàn)有的CRISPR篩查sgRNA庫(kù)融合在一起。
限制：這些方法需要載體來(lái)表達(dá)多聚腺苷化的索引轉(zhuǎn)錄本以及非聚腺苷化的向?qū)NA禽绪。這就限制了單細(xì)胞CRISPR篩選的 規(guī)模蓖救，讓組合式擾動(dòng)難以實(shí)現(xiàn)，或根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)印屁。
參考：
新產(chǎn)品發(fā)布網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)：更快速地獲得單細(xì)胞CRISPR結(jié)果
10x Single Cell CRISPR Screening Videos
