前言
? ? ????小編要分享的這篇文章是2020年10月19發(fā)表在Nature Communications雜志上垦缅，很榮幸征得作者本人（北京林業(yè)大學(xué)林木分子設(shè)計高精尖創(chuàng)新中心博士生 聶帥）的同意寫一篇解讀博客，在此表示感謝懂缕，小編水平有限谣殊，要是有解讀不準(zhǔn)確的地方歡迎廣大朋友指出澄惊。文章研究的是杜鵑花，主要做了三部分內(nèi)容：（1）基因組組裝注釋 （2）基因組進(jìn)化分析 （3）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)分析硬贯。文章大體的研究思路和常見的基因組文章差不多焕襟，甚至沒有做常見的群體進(jìn)化分析，但是它盡然能發(fā)表在NC上饭豹，這和該文章的分析方法創(chuàng)新有關(guān)鸵赖，文章中用到了一些比較新的方法，并且得到了不錯的結(jié)果墨状，小編斷定該文章會出現(xiàn)很多的模仿者
摘要
????????杜鵑花科（Ericaceae）的杜鵑（Azaleas）構(gòu)成了最多樣化的園藝植物之一卫漫，因其文化和經(jīng)濟(jì)重要性而聞名于世。本文中肾砂，作者報道了杜鵑（Rhododendron simsii）的染色體級別基因組組裝列赎，而R. Simsii是目前栽培種杜鵑的主要祖先。基因組分析顯示在杜鵑花科植物的輻射擴(kuò)散之前發(fā)生過一次全基因組復(fù)制事件包吝，并且該WGD事件可能作用于杜鵑開花時間的基因組結(jié)構(gòu)饼煞。小范圍的基因復(fù)制事件作用于參與杜鵑花色素合成的基因家族的擴(kuò)張。作者通過詳細(xì)的時間序列基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析诗越，重構(gòu)了杜鵑花青素和類胡蘿卜素的代謝通路砖瞧，并揭示了其潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MYB嚷狞、bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子可能共同作用于杜鵑中花青素積累的調(diào)控块促，尤其是花著色的起始階段；另外床未，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在后期控制花的漸進(jìn)著色竭翠。本文的工作為理解開花時間和花著色調(diào)控的遺傳機(jī)制提供了基石，可能有助于未來加速杜鵑花的選擇育種
引自：Nature Communications：杜鵑花基因組
背景
? ? ? ? 杜鵑花（Rhododendron simsii）薇搁，又名映山紅斋扰，如下圖，雙子葉植物啃洋，我國十大名花之一传货，東亞特有，世界范圍上種植最廣泛的杜鵑花種類
? ? ? ? 盡管之前研究發(fā)表過兩版杜鵑花的基因組宏娄，但是都只做了二代測序问裕，做到contig版本水平，該文章用了pacbio數(shù)據(jù)绝编，并且掛載了Hi-C僻澎，最后得到13條染色體，為杜鵑花關(guān)鍵性狀遺傳機(jī)制研究和基因組編輯等高效分子設(shè)計育種的建立提供了重要基礎(chǔ)
組裝注釋
如下圖
（1）與另外兩版發(fā)表的基因組比十饥，該基因組用了pacbio數(shù)據(jù)和Hi-C數(shù)據(jù)窟勃，最后掛載到13條染色體上，全基因組大小為528.6M逗堵，共552條scaffold
（2）contig N50為2.23M秉氧，BUSCO評估93.68%，LAI評估18.10蜒秤，這幾個常見的基因組評估指標(biāo)都挺高的
（3）注釋得到34170個編碼基因汁咏，47.48%重復(fù)序列，rcRNA的注釋（482 tRNAs,64 rRNAs,211 miRNAs, 16 tRNAs and 158 snoRNAs）作媚，并給出了一些常用數(shù)據(jù)路能注釋到的基因的比例（NR攘滩，SwissProt,TrEMBL,Pfam,GO, KO）
注：基因組注釋主要包括重復(fù)序列注釋，基因結(jié)構(gòu)注釋纸泡，rcRNA注釋漂问，重復(fù)序列注釋的時候作者詳細(xì)鑒定了LTR-TRs和solo-LTR，Gypsy 占基因組11.90% ，Copia 占基因組4.00%蚤假，整個注釋工作比較復(fù)雜栏饮，用到的軟件非常的多，小編這里不進(jìn)行講述
基因組進(jìn)化分析
（1）比較基因組分析
圖1a：文章用了15個物種加2個外群磷仰，總共聚類得到806個orthogroups單拷貝袍嬉，然后構(gòu)建了ML樹，并計算了一下分歧時間和擴(kuò)張收縮灶平，將大分支Ericales上發(fā)生的WGD以及γ-WGT事件用不同的圖標(biāo)進(jìn)行了標(biāo)注伺通，可以看到，文章研究的杜鵑花和另外兩種杜鵑花在14.54個百萬年發(fā)生分化民逼，在大約78個百萬年的時候有一次WGD事件（使用軟件：OrthoFinder聚類泵殴，MUSCLE比對，IQ-TREE建樹拼苍，MCMCTree算分歧時間，CAFé計算擴(kuò)張收縮）
圖1b：計算Ks值推測WGD事件调缨，下邊的圖計算了五個物種自己的Ks值疮鲫，可以看到，在0.65的時候三種杜鵑花有一個峰值弦叶，在此發(fā)生的WGD事件俊犯，右上角的圖是葡萄與五個物種blast比對得到一對一的orthogroups，然后計算得到伤哺，計算方法見原文燕侠，推算成百萬年后結(jié)果和下邊的圖大概是一致的
圖1c：13條染色體circos圖，由外之內(nèi)分別是Ogre（a family of Gypsy LTRRT）立莉、Tekay（a family of?Gypsy LTR-RT）绢彤、Gypsy LTR-RT、Copia LTR-RT蜓耻、基因密度茫舶、GC含量、共線性區(qū)塊刹淌，該圖特點是將每條染色體的著絲粒位置標(biāo)出來了饶氏，并且將共線性區(qū)塊分成了WGD（紅色）和WGT（藍(lán)色）（咨詢了作者挽拂，杜鵑花的共線性區(qū)塊基本上來自WGD和WGT盏缤，每個區(qū)塊到底是WGD還是WGT沒有一個標(biāo)準(zhǔn)，存在主觀性煎殷，個人以為很多物種的共線性區(qū)塊不僅僅來自加倍化事件蔼卡，作者在這拓展了很好的分析思路）
（2）基因復(fù)制分析
? ? 文章這里用了DupGen_finder軟件【DupGen_finder】喊崖，該軟件能將所有的基因分為五類復(fù)制基因：
WGD：全基因組復(fù)制
TD：串聯(lián)重復(fù)（相鄰的兩個重復(fù)基因）
PD：近端重復(fù)（相隔10個以內(nèi)基因的重復(fù)基因）
TRD：轉(zhuǎn)置重復(fù)（祖先和新基因座組成的重復(fù)基因）
DSD：分散重復(fù)（不相鄰也不共線性的重復(fù)基因）
SL：單拷貝
對這幾類概念感興趣的可以參考：Gene duplication and evolution in recurring polyploidization–diploidization cycles in plants | Genome Biology | Full Text
? ? 可以看到，全基因組所有的基因有89%可以分為這五類，不足的是這個軟件分類得到的結(jié)果假陽性也挺高的贷祈，該文章驗證了假陽性結(jié)果是可以接受的趋急，小編認(rèn)為這篇文章最大的亮點也是最大的創(chuàng)新在于將基因分成了五類復(fù)制然后進(jìn)行接下里的分析
圖2a：五類復(fù)制的ka/ks值箱線圖，可以發(fā)現(xiàn)PD和TD的值較其他三類明顯要高势誊，說明這兩類復(fù)制基因發(fā)生了更多的正選擇呜达，這兩類基因在植物應(yīng)對逆境環(huán)境中有重要的作用，尤其是TD粟耻，所以文章也重點關(guān)注了這兩類復(fù)制基因
圖2b：擴(kuò)張基因（6,754個）查近、復(fù)制基因、正選擇基因（1657個）的venn圖挤忙，先看最外去個大圈和最中間的黃色圈霜威，這是正選擇（EGFs）和五類復(fù)制的venn圖，能看到每一類復(fù)制并且擴(kuò)張基因的個數(shù)册烈，然后看大圈里邊的小圈戈泼，黃線以外是正選擇和復(fù)制基因的交集，黃線以內(nèi)是正選擇和擴(kuò)張基因的交集赏僧，最后發(fā)現(xiàn)所有發(fā)生正選擇和擴(kuò)張的基因中有57.6%由TD和PD引起
圖2c:對發(fā)生擴(kuò)張基因的五類復(fù)制進(jìn)行了GO富集大猛，可以看到，尤其是TD淀零，富集得到一些重要的途徑
圖2d:通過FLOR-ID數(shù)據(jù)庫得到與花周期相關(guān)的基因家族序列挽绩，然后鑒定得到杜鵑花有424個基因與花周期相關(guān)，圖片展示了五類復(fù)制中與花周期有關(guān)的基因個數(shù)驾中，最后發(fā)現(xiàn)了一個OG0000614基因家族（高親和性蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白唉堪，轉(zhuǎn)錄表達(dá)證明在花發(fā)育過程中持續(xù)高表達(dá)）
轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)分析
（1）類胡蘿卜素和花青素/黃酮醇生物合成基因家族轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析
????文章用了五個不同時期的花組織測了表達(dá)量（圖4a），大多數(shù)基因組文章測的是不同組織器官上的表達(dá)肩民，文章后邊用到了一個時間序列分析軟件來分析這有連續(xù)時間差異的五個時期表達(dá)量唠亚，這里也是文章的一個亮點和創(chuàng)新點
圖3：文章鑒定了和類胡蘿卜素、花青素/黃酮醇相關(guān)通路的基因家族此改，上圖是花青素/黃酮醇生物合成的三個重要途徑（Anthocyanin 花青素趾撵、Flavonoids類黃酮素、Flavonol黃酮醇）的基因家族表達(dá)分析共啃，藍(lán)色I(xiàn)D標(biāo)簽是TD占调，棕色標(biāo)簽是PD復(fù)制，在所有這些和花青素/黃酮醇生物合成相關(guān)的基因中TD/PD占了42%移剪，可見這兩類基因在花色調(diào)節(jié)過程中有很重要的作用究珊。但是有意思的是，TD/PD在所有花周期基因家族中的占比很凶菘痢（圖2d）剿涮，總共只有13.66%言津，花周期大多數(shù)由WGD引起。
?（2）時間序列共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析
? ? 文章這里用了TO-GCNs（time-ordered genecoexpression networks）軟件取试，悬槽，時間序列基因共表達(dá)分析軟件，2019年發(fā)表在PNAS上瞬浓，文章鏈接【TO-GCNs】初婆，小編沒有用過，聽作者說挺好用的猿棉，輸入文件為全部的表達(dá)基因和關(guān)注的表達(dá)基因磅叛，就能得到共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。文章發(fā)現(xiàn)了8067個高表達(dá)基因（618個轉(zhuǎn)錄因子TFs和7,449個結(jié)構(gòu)基因）萨赁，用來構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
圖4a：五個不同時期的花組織弊琴，又分成了三個大的時間段initial：T1 、transitional：T2,T3 杖爽、terminal：T4,T5
圖4b：TO-GCNs軟件做出來的時間序列表達(dá)網(wǎng)絡(luò)敲董，文章做的主要是618個TFs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分成了8個系列（結(jié)合表達(dá)熱圖定義成8個系列）掂林，粉色圈內(nèi)的點是五類轉(zhuǎn)錄因子家族（紫色點：MYB臣缀，橄欖色點：bHLH，綠寶石色：WD40泻帮，藍(lán)色：WRKY ，綠色：ERF）的共表達(dá)情況计寇，可以看到尤其在initial階段共表達(dá)特別明顯
圖c：五個不同時期8個系列的表達(dá)熱圖锣杂，可以看到分成八個系列能夠很好的展示出時間序列共表達(dá)情況
（3）initial階段花色有關(guān)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析
? ? 上邊的時間序列共表達(dá)看到，在initial階段共表達(dá)特別明顯番宁，所以文章對這個階段進(jìn)行了與花色有關(guān)基因的共表達(dá)分析元莫，最后推測MYB、bHLH蝶押、WD40三個轉(zhuǎn)錄因子家族可能構(gòu)成復(fù)合體從而共同決定著花色形成
圖5a：類胡蘿卜素生物合成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
圖5b：花青素/黃酮醇生物合成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
圖5c：花青素/黃酮醇相關(guān)基因和MYB踱蠢、bHLH、WD40基因家族的共表達(dá)
圖5d：F3H棋电、MYB茎截、bHLH、WD40在五個時期的表達(dá)熱圖
（4）terminal階段花色有關(guān)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析
? ? 除了initial階段赶盔，terminal階段也有很強(qiáng)的共表達(dá)企锌，所以最后還做了這個階段與花色有關(guān)的共表達(dá)分析
圖6a：花青素/黃酮醇生物合成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
圖6b：F3H、MYB于未、C2H2撕攒、C3H陡鹃、GRAS五類轉(zhuǎn)錄因子基因上游2kb DNA結(jié)合位點情況
圖6c：F3H基因的分級調(diào)控
注：對于各個表達(dá)網(wǎng)絡(luò)更深層次的研究意義小編也是看的很糊涂，大家感興趣可以仔細(xì)研究原文抖坪，能力有限萍鲸，不再擴(kuò)展。
總結(jié)
（1）該研究結(jié)合 Pacbio 長讀長測序與Hi-C技術(shù)擦俐，獲得了映山紅杜鵑高質(zhì)量的基因組組裝和功能注釋
（2）分析了基因組組成特點脊阴，識別了開花調(diào)控基因和花色相關(guān)代謝通路
（3）基于時間序列的基因共表達(dá)分析揭示出與花色決定相關(guān)等級基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，識別到 MYB, bHLH, 和 WD40 三個轉(zhuǎn)錄因子家族成員可能構(gòu)成復(fù)合體從而共同決定著花色形成
