1. 使用SMRT測序檢測真核生物基因組6mA修飾

Zhu S , Beaulaurier J , Deikus G , et al. Mapping and characterizing N6-methyladenine in eukaryotic genomes using single molecule real-time sequencing[J]. Genome Research, 2018, 28(7):gr.231068.117.

這篇文章主要是對幾類研究基因組N6-mA修飾的方法進(jìn)行了比較，并以單細(xì)胞真核生物綠藻和人類基因組出發(fā)眠蚂，提供了一套6mA比對與特征分析的方法碟摆。

Fig 3.png

6mA and depth

motif enrichment score

2. 人類基因組的6mA修飾

Xiao C L , Zhu S , He M , et al. N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome[J]. Molecular cell, 2018, 71(2).

第二篇文章于2018年發(fā)表在Molecular Cell上,由中山大學(xué)中山眼科中心肖傳樂怀读、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院晏光榮、美國費城兒童醫(yī)院王凱迟赃、中國農(nóng)科院谷曉峰、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院伯曉晨等學(xué)者與北京希望組生物科技有限公司共同合作完成厂镇。
該研究從利用PacBio平臺得到的“華夏一號”(HuaXia1)測序數(shù)據(jù)出發(fā)纤壁，結(jié)合6mA-IP-seq, LC-MS/MS, 6mA-IP-qPCR, 6mA-RE-qPCR等技術(shù)首次破譯人類基因組中的N6-甲基腺嘌呤(6mA)修飾圖譜。

簡單來說捺信，這篇文章從“華夏1號”的PacBio三代測序數(shù)據(jù)出發(fā)酌媒，前6個results介紹了PacBio測序?qū)ふ?mA修飾的精準(zhǔn)度，并對基于二代測序的6mA-IP-seq迄靠，基于質(zhì)譜的LC-MS/MS秒咨，以及基于qPCR的6mA-IP-qPCR和6mA-RE-qPCR等方法進(jìn)行驗證和補充說明，結(jié)論是基于二代測序的6mA-IP-seq能夠得到的6mA修飾位點在SMRT的數(shù)據(jù)中都有掌挚，但是位點要顯著少于SMRT測序數(shù)據(jù)能找到的6mA位點雨席。Result-7和Result-8分別介紹了基于猜想尋找人類系統(tǒng)中6mA修飾的甲基化和去甲基化酶，分別是N6MT1和ALKBH1吠式。這里主要是進(jìn)行了一系列細(xì)胞水平的過表達(dá)或者干擾/敲除實驗陡厘，以及體外甲基化實驗。首次鑒定了人類基因組6mA修飾的甲基化酶——N6AMT1特占。最后兩個結(jié)果9和10主要是粗略研究了一下一小部分gastric cancer 和liver cancer病人中的6mA修飾情況以及N6AMT1/ALKBH1的表達(dá)情況糙置，得出癌組織比癌旁組織的6mA修飾少，值得注意的一點是是目，這篇文章當(dāng)中谤饭，對癌和癌旁組織中的6mA進(jìn)行檢測用的方法是免疫組織化學(xué)（IHC），而不是測序的方法胖笛。并且發(fā)現(xiàn)6mA修飾水平和預(yù)后有關(guān)网持。通過對腫瘤細(xì)胞系做N6AMT1和ALKBH1過表達(dá)、沉默實驗發(fā)現(xiàn)6mA修飾水平的高低會影響腫瘤細(xì)胞的增殖长踊、遷移功舀、侵襲等表型。

Fig.1

個人覺得這篇文章值得參考的地方是利用PacBio的測序數(shù)據(jù)去提取修飾信息的Bioinformatics分析部分身弊。

3. 6mA修飾與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

Cell. 2018 Nov 15;175(5):1228-1243.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.10.006. Epub 2018 Nov 1 N6-methyladenine DNA Modification in Glioblastoma.

2018年11月辟汰，來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的Jeremy N. Rich 課題組與耶魯大學(xué)Andrew Z. Xiao課題組合作在Cell上發(fā)表了該篇文章，首次證明了人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因組中有著豐富的6mA修飾阱佛，6mA修飾參與癌癥的發(fā)展帖汞，并發(fā)現(xiàn)靶向6mA去甲基化酶ALKBH1有望成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤新策略。

我個人感覺這篇文章思路比較迷（也許應(yīng)該說比較豐富凑术，所以一遍讀不明白）翩蘸，發(fā)表于第二篇文章之后，出現(xiàn)很多有意思的淮逊，與第二篇文獻(xiàn)的結(jié)論完全相反的結(jié)果催首。在看了Author Contribution之后我的感覺更加強烈——即這篇文章應(yīng)該是兩個競爭課題組后來整合成果共同發(fā)表為一篇文章的套路扶踊。（只是猜測，不一定對哈）由于相對來說這篇文章比肖傳樂的文章更復(fù)雜郎任，所以在附上完整思路整理圖的同時秧耗，我對單個result進(jìn)行拆分梳理如下。前三個結(jié)果主要談?wù)摰氖荖6-mA修飾舶治；后三個結(jié)果主要談?wù)摰氖茿LKBH1這個基因分井。

Fig.2

首先是背景，值得一說的是為什么作者選擇了神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma）來研究DNA的6mA修飾霉猛。Glioblastoma是一種發(fā)病率很高尺锚，并且很具侵略性的原發(fā)性腦腫瘤，這個癌種被證明有廣泛的表觀遺傳修飾失調(diào)惜浅，例如DNA 5mC的高甲基化缩麸、染色質(zhì)重塑酶基因如EZH2和BMI1的表觀修飾變化。然后作者們就選擇了用來自病人的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對DNA 6mA修飾及其功能進(jìn)行研究赡矢。

Result-1 Identification of N6-mA DNA Modifications in Human Glioblastoma

這部分主要用dot blot, MS和免疫細(xì)胞熒光(ICC)三種技術(shù)對Glioblastoma病人衍生的干細(xì)胞GSCs和兩個primary tissues進(jìn)行研究(primary tissues只做了dot blot)，然后發(fā)現(xiàn)在GSCc和primary tissues中的6mA修飾都比human astrocytes (人類形形膠質(zhì)細(xì)胞阅仔，作為normal control)中要高吹散。這個結(jié)論與第二篇肖傳樂等人的文章中得出的‘normal組織中的6mA修飾水平更高’剛好相反。

Result-2 Genomic Profiling and Pattern of N6-mA Glioblastoma

這個部分主要是對兩個GSCs細(xì)胞系和一個primary組織進(jìn)行了N6-mA DIP-seq測序八酒。分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1) 每個樣本能檢測到7,282-17,263個N6-mA peak,這一結(jié)果與2018-molecular cell上發(fā)表的肖傳樂等人的文章中用的6mA-IP-seq在HuaXia1基因組中檢測到的(21,129)差不多空民？(2) 每條染色體上都檢測到了N6mA，其中7號染色體羞迷、19號染色體和21號染色體上最多界轩；而關(guān)于分布的染色體的特征，肖傳樂等人的文章似乎表示6mA在常染色體上的分布是比較均一的衔瓮？(PS: 在文章中進(jìn)行了Genome Background比較得出的這個結(jié)論浊猾，由于我是生信菜鳥，我不太懂热鞍，希望有專業(yè)人士可以指導(dǎo)一下~)(3) GO富集分析發(fā)現(xiàn)m6A修飾的基因主要富集在神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)發(fā)育通路葫慎；(4) motif分析發(fā)現(xiàn)6mA的常見修飾寡核苷酸是GGAAT，肖傳樂等人的文章中得到的motif是[G/C]AGG[C/T]薇宠。

Result-3 N6-mA is enriched in hetrochromatin

作者提出“N6mA是一種抑制性的表觀修飾”偷办。怎么說呢，因為在Result-2中鑒定到的富含6mA修飾的DNA motif- GGAAT-是人類大部分微衛(wèi)星重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)澄港，而人類微衛(wèi)星重復(fù)序列主要在異染色質(zhì)區(qū)域椒涯。所以Result-3就開始探索N6mA與異染色質(zhì)之間的關(guān)系。首先對Result-2部分的三個樣本進(jìn)行了H3K9me3回梧，H3K27me3和H3K4me3的ChIP-seq废岂，發(fā)現(xiàn)80%的N6-mA的峰能和異染色質(zhì)marks祖搓，即H3K9me3, H3K27me3重合。之后又對387這個GSC做了WGBS (全基因組甲基化測序)泪喊，發(fā)現(xiàn)有輕微差異棕硫。（小聲：連顯著性都沒標(biāo)是不是因為沒有顯著差異，23333）

Result-4 ALKBH1 Is a DNA N6-mA Demethylase that Actively Modulates Gene Expression in Human Glioblastoma

這個結(jié)果部分首先對ALKBH1這個基因進(jìn)行體外和體內(nèi)實驗袒啼，均證明能影響6mA的量哈扮；最重要的是，這篇文章也做了N6AMT1這個基因蚓再，通過CRISPR構(gòu)建N6AMT1敲除的細(xì)胞系的6mA修飾水平?jīng)]有發(fā)生變化滑肉。體外的實驗也沒有變化。這里有幾個地方我個人認(rèn)為比較不明確：首先摘仅，做CRISPR-Cas9敲除的GSCs細(xì)胞系未告知明確是哪個靶庙；然后做dot blot的DNA用量也沒有標(biāo)明。因此不能和肖傳樂等人的文章進(jìn)行更精確的比較娃属。
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還有不解的是：后面他們先是做了CRISPR敲除ALKBH1基因的細(xì)胞系六荒，然后去做了RNAseq，得到表達(dá)變化了的差異基因矾端；然后他們用shRNA干擾ALKBH1表達(dá)的細(xì)胞做N6-mA DIP-seq去找ALKBH1被knockdown之后N6mA修飾發(fā)生改變的位點掏击，然后比較ALKBH1被敲除后表達(dá)下調(diào)的基因的N6-mA的修飾的變化情況。為什么不直接用ALKBH1-KO的細(xì)胞系做N6-mA DIP-seq呢秩铆？砚亭？？關(guān)鍵是他文寫的還是'after ALKBH1 deleption'殴玛？捅膘？？感覺略混亂啊滚粟。寻仗。
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繼續(xù)‘震驚’的是，他們又做了ATAC-seq坦刀，發(fā)現(xiàn)ATAC-seq的峰剛好和N6-mA DIP-seq的峰呈負(fù)相關(guān)愧沟。。鲤遥。這思路真(kan)清(bu)奇(dong)沐寺。。盖奈。難道前面不是已經(jīng)證明了N6-mA喜歡在異染色質(zhì)區(qū)域嗎混坞？異染質(zhì)區(qū)域難道不是開放性弱的區(qū)域嗎？？那么不是理論上就是在ATAC-seq不能拉到的區(qū)域嗎究孕？啥酱？
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然后，為了搞明白ALKBH1到底是怎么去掉N6-mA修飾的厨诸，他們做了ALKBH1 pull-down實驗镶殷。發(fā)現(xiàn)ALKBH1喜歡跑到帶有N6-mA修飾的寡聚核苷酸那里去。微酬。為了解釋這種現(xiàn)象绘趋，他們又做了ALKBH1的ChIP-seq。颗管。陷遮。然后發(fā)現(xiàn)ALKBH1 ChIP-seq的峰和N6mA的峰重疊。垦江。然后得到的結(jié)論是：ALKBH1是一個轉(zhuǎn)錄因子帽馋，它跑到N6-mA富集的地方去并且移除N6-mA修飾的抑制作用。比吭。思路繞嗎绽族？？可能CNS級文章就是這樣吧衩藤。项秉。

Result-5 ALKBH1 Depletion Facilitates Heterochromatin Formation in Human Glioblastoma through N6-mA DNA Modification

第五個結(jié)果比較簡單，但是到了第五個結(jié)果這里慷彤，ALKBH1, Histone modification (eg, H3K9me3), N6-mA modification和Gene expression這4者之間的關(guān)系其實相對來說似乎就明朗了。
(1) ALKBH1升高會減少N6-mA的修飾怖喻；
(2) N6-mA修飾減少會去掉基因表達(dá)的抑制性修飾底哗，所以理論上來說正常組織中帶有較多N6-mA修飾的基因在ALKBH1表達(dá)升高之后它們的表達(dá)也會升高，即ALKBH1的水平與基因表達(dá)呈正相關(guān)锚沸；
(3) N6-mA修飾與H3K9me3的修飾peaks高度重疊跋选；
所以在第五個結(jié)果里，通過對ALKBH1 knockdown的細(xì)胞系做H3K9me3 ChIP-seq哗蜈，彌補上了ALKBH1與H3K9me3的關(guān)系前标。本文的研究結(jié)果是：檢測到ALKBH1 knockdown的細(xì)胞系基因組中有更多H3K9me3 peaks，因此認(rèn)為ALKBH1可以調(diào)控組蛋白修飾的形成距潘。

Result-6 ALKBH1 regulates hypoxia response genes

Result-7 N6-mA Is a Potential Therapeutic Target in Glioblastoma

這篇文章內(nèi)容很豐富炼列，思路很豐滿，太累了音比。后面主要是設(shè)計了相對完整的對照實驗做RNAseq等實驗證明N6-mA與缺氧調(diào)控通路的關(guān)系俭尖，以及去做了個ALKBH1敲除后的腫瘤細(xì)胞表型實驗等。

4. 哺乳動物胚胎干細(xì)胞ESC中的6mA修飾

Wu T P , Wang T , Seetin M G , et al. DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells[J]. Nature, 2016.

這篇文章的通訊作者同時也是2018年在Cell上發(fā)表了N6mA修飾在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤當(dāng)中的作用的通訊作者之一。這篇文章在小鼠胚胎干細(xì)胞基因組中發(fā)現(xiàn)了6mA修飾稽犁，同時證明ALKBH1編碼了一個N6mA的去甲基化酶焰望，并且敲低ALKBH1表達(dá)的細(xì)胞中N6-mA的水平增加，某些關(guān)鍵基因的表達(dá)下調(diào)已亥。最后他們發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞中熊赖，不同于以前研究的其他物種基因組，N6-mA的積累作為一個表觀沉默機制發(fā)揮作用虑椎，例如控制轉(zhuǎn)座子LINE-1的活性等震鹉。

2016-neture-6mA+in+mammalian+ESCs.png

5. 小鼠腦組織中的6mA修飾受到環(huán)境壓力的動態(tài)調(diào)控

Yao B , Cheng Y , Wang Z , et al. DNA N6-methyladenine is dynamically regulated in the mouse brain following environmental stress[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):1122.

這篇文章發(fā)表于第四篇文章之后足陨，當(dāng)哺乳動物細(xì)胞基因組中被報道有6mA修飾之后，亞特蘭大埃默里大學(xué)醫(yī)學(xué)院人類遺傳學(xué)系的Peng Jin研究員發(fā)現(xiàn)在（1）小鼠腦組織的DNA中娇未，6mA修飾的水平隨著壓力顯著上升墨缘；（2）通過運用全基因組6mA圖譜分析以及轉(zhuǎn)錄組圖譜分析，他們發(fā)現(xiàn)6mA的動態(tài)改變與一系列神經(jīng)元基因的上調(diào)及LINA1轉(zhuǎn)座子表達(dá)的下調(diào)呈負(fù)相關(guān)零抬；（3）受到6mA修飾水平改變的基因大多都是神經(jīng)疾病發(fā)生相關(guān)的基因镊讼。這些結(jié)果表明6mA是一個調(diào)控腦發(fā)育及神經(jīng)疾病發(fā)生相關(guān)的表觀因素。這是一篇揭示慢性壓力對基因組表觀修飾變化以及神經(jīng)疾病發(fā)生的相關(guān)性的文章~ 我個人對于精神壓力等如何引起抑郁癥等精神疾病比較感興趣平夜。

這篇文章的第二個結(jié)果蝶棋，通過6mA-IP-seq測了3對stress/control鼠腦PFC區(qū)的6mA變化，得到主要變化——不論gain 6mA還是loss-of 6mA都是發(fā)生在intergenic基因間區(qū)忽妒。當(dāng)關(guān)注基因內(nèi)的6mA變化時玩裙，發(fā)生主要是發(fā)生在introl區(qū)。而2018-Moleculer Cell-肖傳樂等人的文章的結(jié)果是6mA在基因內(nèi)intragenic的修飾區(qū)域主要是在exon區(qū)段直。在第四個結(jié)果里吃溅，通過對RNAseq的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并且結(jié)合6mA-IP-seq數(shù)據(jù)鸯檬，把所有基因分為以下四類：① gain-of-6mA/upregulated; ② gain-of-6mA/downregulated; ③ loss-of-6mA/upregulated; ④ loss-of-6mA/downregulated决侈。GO分析之后發(fā)現(xiàn)只有第③類loss-of-6mA/upregulated的基因能夠富集到與神經(jīng)發(fā)育及功能相關(guān)的通路上。

2017-NC-6mA+is+dynamically+regulated+in+mouse+brain.png

6. 在斑馬魚和豬的早期胚胎發(fā)育過程中基因組DNA含有豐富的6mA修飾

Liu J , Zhu Y , Luo G Z , et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig[J]. Nature Communications, 2016, 7:13052.

這篇文章來自三個單位的合作功茴，分別是芝加哥大學(xué)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院（何川）庐冯，中國科學(xué)院動物研究所生殖生物學(xué)國家重點實驗室（陳大華研究員），以及浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（汪以真院長）坎穿。這篇文章主要以斑馬魚和豬為關(guān)注對象肄扎，研究胚胎發(fā)育的過程中基因組6mA修飾的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在早期胚胎發(fā)育的過程中基因組重復(fù)序列區(qū)域的6mA顯著增加，約占所有A的0.1%-0.2%犯祠，隨著發(fā)育完成又恢復(fù)到正常狀態(tài)旭等。

這篇文章比較短，只有7頁pdf衡载，接下來按照文章給出的result來理一下整個項目的思路搔耕。
首先第一個結(jié)果部分(1) DNA 6mA modification during early embryogenesis of zebrafish，作者主要利用UHPLC-QQQ-MS/MS超高分辨率-三重四級桿-串聯(lián)質(zhì)譜痰娱，以斑馬魚為模型弃榨，非常細(xì)致地研究了斑馬魚的精細(xì)胞、卵子梨睁、早期胚胎發(fā)育的各個細(xì)胞時期（受精卵鲸睛、2細(xì)胞、4細(xì)胞坡贺、8細(xì)胞官辈、16細(xì)胞、32細(xì)胞遍坟、64細(xì)胞拳亿、128細(xì)胞、256細(xì)胞愿伴、512細(xì)胞時期）以及成年斑馬魚的不同組織器官（包括腦肺魁、眼睛、心臟隔节、卵巢鹅经、精囊、肌肉和腸）進(jìn)行了6mA豐度研究怎诫，平均每一個實驗組需要約10,000個細(xì)胞提取的基因組DNA瞬雹。結(jié)果表明精細(xì)胞中6mA/A的比例約在0.003%，卵母細(xì)胞中約為0.015%刽虹；在32-64細(xì)胞時期6mA/A的比例達(dá)到最高，約為0.1%呢诬，之后慢慢下降涌哲，直至回歸原始基因組水平。
同時成年斑馬魚的不同組織器官中6mA/A的豐度也是符合一般水平尚镰，無明顯變化阀圾。

Fig-1 6mA/A ratio in zebrafish

Fig-2 免疫熒光染色

Fig-3 6mA in pig genome

Fig-4 6mA測序reads分布區(qū)域

Fig-5 6mA修飾主要在exon區(qū)