擬南芥磷脂酰肌醇4,5-二磷酸通過(guò)控制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)影響PIN極化
實(shí)驗(yàn)方法
生長(zhǎng)素含量的測(cè)定
生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定
全組織的PIN的免疫熒光（PIN1和PIN2有商業(yè)化抗體）
CHX和BFA的處理
知識(shí)點(diǎn)
DR5::GFP猴凹，DR5::GUS定位
- 根尖
PIN1-GFP磨澡，PIN2-GFP的熒光定位俱饿，免疫熒光定位
PIN1-GFP主要定位于（中柱）細(xì)胞的基底側(cè)
PIN2-GFP定位在皮層細(xì)胞的頂端
BFA處理
- 形成BFA小體
PIN相關(guān)的部分實(shí)驗(yàn)
1原献、生長(zhǎng)素含量的測(cè)定
????pip5k1 pip5k2雙突表型：短根登舞，矮小。生長(zhǎng)素水平正常窝剖，但是PIN1-GFP和PIN2-GFP的定位不正常
????PIN蛋白的極性分布是由于蛋白在不斷地循環(huán)棠隐，運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜上的特定位置造成的
????HPLC-ms測(cè)定幼苗的游離生長(zhǎng)素含量，雙突中生長(zhǎng)素含量不變轻黑，但是從上向下的運(yùn)輸減少了【測(cè)定生長(zhǎng)素的向基性運(yùn)輸糊肤，這咋測(cè)的，方法中有描述】
????含量沒(méi)變氓鄙，運(yùn)輸變了
2馆揉、用DR5::GFP看生長(zhǎng)素的分布情況
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發(fā)現(xiàn)雙突中DR5::GFP信號(hào)低，也不能響應(yīng)外源IAA的施加抖拦。
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3升酣、進(jìn)一步在雙突背景下轉(zhuǎn)DR5::GUS
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雙突中DR5::GUS活性仍然低，IAA處理后也無(wú)法響應(yīng)态罪，對(duì)于NAA和2噩茄，4D有部分響應(yīng)
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????到底是生長(zhǎng)素的感知有問(wèn)題還是生長(zhǎng)素的運(yùn)輸有問(wèn)題呢？
4复颈、雙突中生長(zhǎng)素的感知有沒(méi)有問(wèn)題：
????IAA绩聘，NAA, 2-4D處理后，測(cè)量對(duì)照組和雙突的根長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)抑制作用類似凿菩。說(shuō)明在雙突中生長(zhǎng)素的異常机杜，不是由于感知生長(zhǎng)素異常，而是通過(guò)影響生長(zhǎng)素的運(yùn)輸衅谷。并且該實(shí)驗(yàn)暗示椒拗，外源施用IAA，并沒(méi)有增加雙突的根長(zhǎng)【應(yīng)該還需要做一組不處理的進(jìn)行比較吧】
????可溶酶的典型定位特征：清晰的質(zhì)膜定位和微弱的胞質(zhì)定位
????EYFP-PIP5K1 和 PIP5K2-EYFP具有極性定位获黔，定位在質(zhì)膜的頂端和基部蚀苛。B中是脂質(zhì)分布的marker＄枋希【量化的方法枉阵？？】
5预茄、是否改變PIN的分布
在野生型中，與之前報(bào)道的定位一致：
????PIN1-GFP主要定位于（中柱）細(xì)胞的基底側(cè)
????PIN2-GFP定位在皮層細(xì)胞的頂端
在雙突中侦厚，PIN1-GFP的熒光強(qiáng)度變?nèi)醭苌拢鼜浬ⅲ浑p突中PIN2-GFP在側(cè)邊有時(shí)也有信號(hào)刨沦；
這表明诗宣，該基因的缺失，干擾了PIN1和PIN2的極化
????那過(guò)表達(dá)該基因是否會(huì)影響極化呢想诅？
????用PIN1和PIN2的特異性抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)【免疫熒光召庞？】，在野生型中展示的定位也與報(bào)道一致来破。
????在過(guò)表達(dá)材料中進(jìn)行免疫定位顯示篮灼，PIN1的熒光強(qiáng)度和定位與對(duì)照相似，但在相同的條件下徘禁，PIN2的定位與對(duì)照明顯不同诅诱，展示出了較弱的質(zhì)膜極性【為啥突變體的材料可以轉(zhuǎn)PIN1-GFP直接看GFP，而過(guò)表達(dá)的材料送朱，要用免疫熒光娘荡，沒(méi)有一起過(guò)表達(dá)PIN-GFP呢】
????過(guò)表達(dá)材料中，PIN2定位受到干擾驶沼，推測(cè)是由于PIN2的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)受到干擾造成的（與本文中的基因功能相關(guān)炮沐，這里不作具體展開(kāi)）
6、評(píng)估降低PtdIns(4,5)P2水平對(duì)PIN1-GFP和PIN2-GFP內(nèi)吞循環(huán)的影響,
cycloheximide (CHX)環(huán)己酰亞胺回怜，蛋白合成抑制劑
Brefeldin A (BFA) 是一種內(nèi)酯抗生素大年，是蛋白質(zhì)運(yùn)輸的特定抑制劑。通過(guò)阻止COPI被膜小泡的形成阻斷分泌蛋白和膜蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，文中說(shuō)注意不要超過(guò)25 μM BFA】
????正常的野生型中鲜戒，用BFA處理幾分鐘到60min即可觀察到BFA小體的形成专控，表明，正常條件下遏餐，在質(zhì)膜和endosomal compartments之間存在著大量的PIN1-GFP或者PIN2-GFP的消化循環(huán)伦腐。
????但在雙突中，PIN1-GFP和PIN2-GFP經(jīng)BFA處理后失都，形成的BFA小體明顯減少柏蘑，表明其內(nèi)吞循環(huán)受阻。
補(bǔ)充材料PIN1-GFP和PIN2-GFP的正常定位粹庞，和BFA處理后定位
BFA處理
