板塊“白話單細(xì)胞”代號(hào)“Vernacular”（白話）目標(biāo)是用最通俗易懂的語言食茎，把單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)內(nèi)容給大家講懂。
不知道各位看官有木有發(fā)現(xiàn)试浙，最近高分文章都開始頻繁使用一個(gè)技術(shù)董瞻，那就是mIHC。小編去PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索了一下田巴，嚯钠糊，相關(guān)文章還真不少呢，且文獻(xiàn)數(shù)量逐年飆升壹哺。

圖1（截至2023年6月）

根據(jù)期刊影響因子將文獻(xiàn)分為四個(gè)水平：“≥20”抄伍、“10～20”、“5~10”和“<5”管宵，繪制五年內(nèi)不同水平期刊的數(shù)目和文獻(xiàn)數(shù)量折線圖（圖2）截珍，可發(fā)現(xiàn)中、高等水平期刊（“5～10”箩朴、“>20”）逐年增加岗喉，尤其是中等水平期刊刊載的文章，5年增長(zhǎng)了將近4倍呀炸庞！

圖2（截至2023年6月）

那這到底是何方神圣呢钱床？

多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)?(Multiplex Immunohistochemical，mIHC) ?是為了解決傳統(tǒng)技術(shù)在研究腫瘤免疫微環(huán)境中的弊端而生的一項(xiàng)技術(shù)埠居，它作為近幾年全球熱點(diǎn)技術(shù)查牌，在腫瘤治療事期、神經(jīng)科學(xué)、干細(xì)胞研究纸颜、器官移植等多個(gè)領(lǐng)域都有重要的研究成果報(bào)道兽泣，為多種疾病精準(zhǔn)診療指明了新方向。

隨著腫瘤免疫微環(huán)境研究成為腫瘤精準(zhǔn)診療基礎(chǔ)胁孙，既往的病理診斷技術(shù)均暴露出一定的局限性唠倦，無法適應(yīng)下一代診斷病理學(xué)的需求。例如浊洞，免疫熒光 (Immunofluorescence牵敷，IF) 僅能標(biāo)記2-3個(gè)指標(biāo)，難以準(zhǔn)確刻畫復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境的真實(shí)特征法希；免疫組化 (Immunohistochemistry枷餐，IHC) 可通過連續(xù)切片進(jìn)行多指標(biāo)標(biāo)記，但無法準(zhǔn)確分析各個(gè)蛋白苫亦、細(xì)胞間的相關(guān)性毛肋，只能進(jìn)行定性判讀且存在人為主觀性；流式細(xì)胞術(shù)和基因檢測(cè)可以獲得大量細(xì)胞和基因?qū)用娴男畔⑽萁＃笔Я怂眯畔⒌脑豢臻g位置關(guān)系润匙。

mIHC可以在細(xì)胞或組織樣本原位上檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)，通過這些靶點(diǎn)的組合和位置關(guān)系的研究唉匾，進(jìn)而闡明其相互作用機(jī)理孕讳。該項(xiàng)技術(shù)不僅可大幅提高被檢測(cè)信號(hào)的靈敏度，同時(shí)也可解決了在同一張切片上進(jìn)行多種同種屬生物標(biāo)志物檢測(cè)的難題巍膘，通過定量病理分析可獲得組織細(xì)胞原位各種靶標(biāo)類別厂财、組分、表達(dá)量等信息峡懈，各靶標(biāo)及其相互作用的空間定位璃饱、定性和定量等信息，全面肪康、系統(tǒng)荚恶、直觀、科學(xué)地解析這些信息對(duì)于研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制磷支，對(duì)于探討疾病診斷和治療疾病的有效方法有著重要意義谒撼。

如何實(shí)現(xiàn)以上優(yōu)勢(shì)？

根據(jù)mIHC所使用的技術(shù)原理雾狈，如圖3所示廓潜，可以將其分為 (A) 基于顯色染料技術(shù)、 (B) 基于金屬同位素技術(shù)、 (C) 基于熒光技術(shù)和 (D) 基于DNA barcode技術(shù)等四大技術(shù)平臺(tái)[1]茉帅。

圖3

A、基于顯色染料的mIHC

典型的代表是羅氏的DISCOVERY ULTRA锭弊，原理是經(jīng)典的IHC的一抗捕獲+二抗顯色的結(jié)構(gòu)堪澎，顯色底物是類似DAB的顯色染料，不過由于它們有較廣的光吸收譜味滞，會(huì)形成一種在光學(xué)顯微鏡下容易區(qū)分的深色染色圖樱蛤，如下圖4所示。DISCOVERY ULTRA技術(shù)不需要另行購(gòu)置配套的光學(xué)顯微鏡剑鞍，使用常規(guī)光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行原位表達(dá)分析昨凡，檢測(cè)多重共定位靶標(biāo)。但是它沒有配套的分析軟件進(jìn)行定性或定量分析蚁署，多靶標(biāo)的共定位結(jié)果分析有一定的難度便脊。它的靶標(biāo)檢測(cè)通量相對(duì)較低，最多可以同時(shí)檢測(cè)5個(gè)靶點(diǎn)光戈。

圖4

B哪痰、基于金屬同位素的mIHC

基于金屬同位素技術(shù)的mIHC有兩個(gè)代表性的平臺(tái)，一個(gè)是成像質(zhì)譜流式技術(shù)（Imaging Mass Cytometry久妆，IMC）晌杰，它依靠高分辨率的激光燒蝕技術(shù)和質(zhì)譜流式技術(shù)的結(jié)合，理論上最高檢測(cè)指標(biāo)可達(dá)100個(gè)筷弦，根據(jù)目前可以用的同位素類型肋演，實(shí)踐中可以同時(shí)檢測(cè)超過40 個(gè)靶標(biāo)。IMC平臺(tái)的缺點(diǎn)在于圖形獲取速度非常慢烂琴，它是通過免疫熒光的顯色圖來選擇特定區(qū)域進(jìn)行分析的爹殊，如下圖5所示為IMC的人組織顯色圖，對(duì)于一個(gè)1000um2的組織區(qū)域监右，需要耗時(shí)2h來完成數(shù)據(jù)獲取 边灭，另外由于它是單抗體顯色的平臺(tái)，缺少二抗及后續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)效應(yīng)健盒，它的靈敏度要比 IF 低绒瘦，而且激光光斑的精度所限，它的分辨率設(shè)定為1um扣癣，比其他mIHC技術(shù)都要低惰帽。

圖5

另一個(gè)技術(shù)平臺(tái)是多重離子束成像技術(shù) (Multiplexed Ion Beam Imaging，MIBI) 父虑，檢測(cè)靶標(biāo)數(shù)可達(dá)40-100個(gè)该酗。它有一個(gè)配套的成像和分析軟件平臺(tái) MIBItracker Software ，可以在多個(gè)分辨率下進(jìn)行重掃描，獲得亞細(xì)胞定位信息呜魄，它不僅可以獲取免疫細(xì)胞浸潤(rùn)悔叽、細(xì)胞形態(tài)和空間定位，同時(shí)也可以獲得蛋白的定量表達(dá)結(jié)果爵嗅。但是空間位阻和非特異性吸附依然是它的一個(gè)挑戰(zhàn)娇澎，合適的染色和成像也有一定的難度，還有一個(gè)缺點(diǎn)是它的成本非常高睹晒。

圖6[2]

C趟庄、基于熒光成像的mIHC

Vectra是一個(gè)基于免疫熒光的多重IHC/IF檢測(cè)技術(shù)，通過多次染色循環(huán)伪很，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)9個(gè)靶標(biāo)（如圖7所示）戚啥。每一次染色循環(huán)后，需要洗去上一循環(huán)留下的染色標(biāo)記锉试，因此徹底清除多重染色循環(huán)間的檢測(cè)殘留是Vectra的一個(gè)挑戰(zhàn)猫十。這個(gè)技術(shù)是過去5年中最為廣泛采用的mIHC技術(shù)之一，已經(jīng)有醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)采用它作為臨床檢測(cè)平臺(tái)以幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行臨床診斷〈舾牵現(xiàn)在已經(jīng)有了很多自動(dòng)化的染色設(shè)備如Leica Bond Max炫彩，一天可以完成30張七色病理切片的染色。

圖7

D絮短、 基于DNA barcode的mIHC

基于DNA Barcode的技術(shù)主要包括兩種江兢，一種是DSP空間多組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，它的實(shí)現(xiàn)原理是依靠一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的連接了DNA barcode的抗體丁频，檢測(cè)抗體與DNA barcode間通過一個(gè)紫外光解的連接子連接杉允，可以在紫外光的照射下釋放DNA barcode，對(duì)DNA barcode進(jìn)一步的測(cè)定即可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的定量檢測(cè)席里，同樣的由于使用DNA barcode進(jìn)行靶標(biāo)的區(qū)分叔磷，突破了熒光圖像的可用通道數(shù)的限制。通過選擇合適的區(qū)域進(jìn)行測(cè)定奖磁，可以實(shí)現(xiàn)空間蛋白組學(xué)的多重靶點(diǎn)的定量檢測(cè)改基。DSP并不局限于蛋白靶點(diǎn)檢測(cè)，也可以進(jìn)行RNA靶標(biāo)的檢測(cè)咖为，使用經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行靶標(biāo)吸附秕狰，相比傳統(tǒng)的RNA-seq，DSP除了有空間定位信息外躁染，還可以檢測(cè)到低豐度基因表達(dá)數(shù)據(jù)鸣哀。

圖8

另外一個(gè)CO detection by indEXing (CODEX)技術(shù)也是依賴于多重染色技術(shù)實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測(cè)，其核心設(shè)計(jì)原理是每種抗體上標(biāo)記特異性寡核苷酸“條碼標(biāo)簽”(Barcode)吞彤，成像所需的熒光染料是通過和Barcode互補(bǔ)序列特異性結(jié)合我衬，使得該技術(shù)突破可見光譜熒光成像通道數(shù)量的限制叹放。

圖9[3]

如何讓mIHC為我們的文章服務(wù)？

mIHC的應(yīng)用的場(chǎng)景是非常的廣泛的挠羔，比如：組織微環(huán)境特征分析及生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)井仰；臨床試驗(yàn)病人入組分析；生物標(biāo)志物定量檢測(cè)及藥效預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估破加；分析疾病微環(huán)境中各種類型細(xì)胞間的空間分布關(guān)系糕档；復(fù)雜細(xì)胞表型、功能狀態(tài)的判別拌喉；分子分型；TILs（腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞）分析俐银、腫瘤浸潤(rùn)邊界特征分析尿背；用于推演信號(hào)通路上、下游分子協(xié)同表達(dá)的關(guān)系等捶惜。下面是幾個(gè)應(yīng)用實(shí)例：

應(yīng)用實(shí)例一：腫瘤免疫浸潤(rùn)

乳腺癌 (Breast Cancer,BC) 中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (Tumor-infiltrating Lymphocytes,TILs)的數(shù)量是提高患者生存率的強(qiáng)有力的預(yù)后因素田藐，尤其是在三陰性 (Triple-negative Breast Cancer,TNBC) 和 HER2 過表達(dá)的 BC 亞型中。盡管 T 細(xì)胞是 TILs 中主要的群吱七，但 T 細(xì)胞亞群的數(shù)量和差異與患者預(yù)后之間的關(guān)系仍未可知汽久。

Peter Savas[4]等人利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)較多數(shù)量的 CD8+ T細(xì)胞與表達(dá) CD103 的這些細(xì)胞之間存在顯著相關(guān)性，并利用mIHC 可以獲得各靶標(biāo)及其相互作用的空間定位踊餐、定性和定量等信息的特點(diǎn)景醇，在原發(fā)性 TNBC 中證實(shí)了同樣表達(dá) CD103 的 CD8+ T 細(xì)胞的存在（圖10）。作者的研究揭示了 BC 中 CD8+T 細(xì)胞差異吝岭，并證實(shí)差異細(xì)胞中基因標(biāo)志和 TNBC 的存活率提高之間存在顯著關(guān)聯(lián)三痰，為進(jìn)一步了解 T 細(xì)胞亞群的發(fā)育、維持和調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)窜管。

圖10

應(yīng)用實(shí)例二：腫瘤微環(huán)境研究

Halse, H[5]等人運(yùn)用 mIHC 對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中的免疫亞群進(jìn)行精準(zhǔn)定位散劫，數(shù)據(jù)量化了腫瘤內(nèi) (Intra-tumor, IT) 與腫瘤基質(zhì) (Peri-tumoral, stroma) 的免疫亞群數(shù)量，以及免疫亞群與 (Tumor margin, TM) 的距離幕帆。

如圖11所示获搏，使用 mIHC 在特定腫瘤區(qū)域分析轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中免疫亞群的精確位置，觀察不同免疫亞群在瘤內(nèi)的表達(dá)情況失乾。結(jié)果顯示常熙，對(duì)于黑色素瘤的 MelTIL026 (盆腔淋巴結(jié)) 切片，大多數(shù) T 細(xì)胞為 CD4+T 細(xì)胞碱茁，且在腫瘤邊緣 (TM) 和間質(zhì)區(qū)域 (S) 突出症概，在腫瘤內(nèi) (IT) 區(qū)域CD4+和CD8+ T細(xì)胞數(shù)量較少。

圖11

應(yīng)用實(shí)例三：腫瘤免疫治療分析

癌癥免疫療法為應(yīng)答患者提供了生存益處早芭，但許多患者未能應(yīng)答彼城。識(shí)別治療反應(yīng)和耐藥性的生物學(xué)特性是優(yōu)化藥物選擇和改善患者結(jié)果的首要任務(wù)。Tuba N Gide[6]等人對(duì)158個(gè)黑色素瘤患者的腫瘤活檢進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和免疫分析，這些患者接受了抗PD-1單藥治療（n = 63）或抗PD-1和抗CTLA-4聯(lián)合治療（n = 57）募壕。并使用mIHC量化黑色素瘤活檢中的T細(xì)胞和已知預(yù)測(cè)標(biāo)記物（PD-L1）的密度和空間位置（圖12）调炬，結(jié)果顯示對(duì)單一療法和聯(lián)合免疫療法有反應(yīng)的患者在治療前和治療期間有較高的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，與之前的研究和數(shù)據(jù)一致舱馅。

這些免疫細(xì)胞群的量化確定了應(yīng)答者在兩種治療中激活的T細(xì)胞特征和T細(xì)胞群缰泡，可用于預(yù)測(cè)患者對(duì)當(dāng)前基于反PD-1的治療方法的反應(yīng)，為癌癥患者的治療選擇和未來治療策略提供了重要信息代嗤。

圖12

mIHC技術(shù)作為當(dāng)今腫瘤課題領(lǐng)域的最新技術(shù)棘钞，可從三個(gè)維度（定性、定量干毅、定位）定義和刻畫腫瘤微環(huán)境宜猜，其優(yōu)秀的數(shù)據(jù)整合能力及廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景更能為您的文章增光添彩！還愣著干嘛呀硝逢，快來找我們聊聊怎么開展實(shí)驗(yàn)吧～

參考文獻(xiàn)

[1] Tan, Wei Chang Colin et al. “Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.” Cancer communications (London, England) vol. 40,4 (2020): 135-153. doi:10.1002/cac2.12023

[2] Keren, Leeat et al. “MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure.” Science advances vol. 5,10 eaax5851. 9 Oct. 2019, doi:10.1126/sciadv.aax5851

[3] Black, Sarah et al. “CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.” Nature protocols vol. 16,8 (2021): 3802-3835. doi:10.1038/s41596-021-00556-8

[4]Savas, Peter et al. “Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis.” Nature medicine vol. 24,7 (2018): 986-993. doi:10.1038/s41591-018-0078-7

[5] Halse, H et al. “Multiplex immunohistochemistry accurately defines the immune context of metastatic melanoma.” Scientific reports vol. 8,1 11158. 24 Jul. 2018, doi:10.1038/s41598-018-28944-3

[6] Gide, Tuba N et al. “Distinct Immune Cell Populations Define Response to Anti-PD-1 Monotherapy and Anti-PD-1/Anti-CTLA-4 Combined Therapy.” Cancer cell vol. 35,2 (2019): 238-255.e6. doi:10.1016/j.ccell.2019.01.003