作者梅垄，追風(fēng)少年i
周四了，馬上一周又要過去了娇豫，今天呢耀找，分享一篇文章此洲，文章在Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma,空間多組學(xué)分析破譯膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,值得我們研究一下厂汗。不得不說現(xiàn)在的研究都是以大樣本量著稱。
summary呜师，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是由于局部環(huán)境的異質(zhì)性
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤娶桦，其特點(diǎn)是亞克隆多樣性和發(fā)育等級中的動(dòng)態(tài)適應(yīng)。在這些腫瘤的空間背景下動(dòng)態(tài)重組的來源仍然難以捉摸汁汗。在這里衷畦，通過空間分辨的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)來表征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤知牌。通過破譯患者之間區(qū)域共享的轉(zhuǎn)錄程序祈争，推斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是由譜系狀態(tài)的空間分離組織的，并適應(yīng)炎癥和/或代謝刺激角寸，讓人聯(lián)想到成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性轉(zhuǎn)化菩混。代謝成像和成像質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的整合揭示了局部區(qū)域腫瘤宿主的相互依賴性，從而產(chǎn)生了空間專有的適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄程序扁藕。推斷拷貝數(shù)改變強(qiáng)調(diào)與反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄程序相關(guān)的亞克隆的空間凝聚組織沮峡，證實(shí)環(huán)境壓力會(huì)引起選擇壓力（環(huán)境選擇）。植入人類和嚙齒動(dòng)物新皮質(zhì)組織的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞模型模擬各種環(huán)境證實(shí)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)源于對各種環(huán)境的動(dòng)態(tài)適應(yīng)亿柑。
INTRODUCTION（空間多組學(xué)的必要性）
單細(xì)胞技術(shù)為健康人腦和惡性腫瘤中單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和動(dòng)態(tài)進(jìn)化提供了見解帖烘。高級別和低級別膠質(zhì)瘤的scRNA-seq研究表明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和跨細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)可塑性是惡性腦腫瘤的標(biāo)志，包括間充質(zhì)樣（MES-like）橄杨、神經(jīng)祖細(xì)胞樣（NPC-like）、星形膠質(zhì)細(xì)胞樣（AC-like）和少突前體細(xì)胞樣（OPC-like）狀態(tài)照卦。既往研究往往忽略了局部微環(huán)境在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用式矫，單細(xì)胞分析僅能提供細(xì)胞間相互作用的推斷，但空間組織信息是缺失的役耕，因而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的出現(xiàn)使得原位表征惡性腦腫瘤的細(xì)胞間和微環(huán)境間作用成為可能采转。除了轉(zhuǎn)錄組外，代謝因素對膠質(zhì)瘤的動(dòng)態(tài)適應(yīng)產(chǎn)生決定性影響，例如缺氧導(dǎo)致的代謝惡化顯著推動(dòng)了基因組不穩(wěn)定性故慈，人們也越來越關(guān)注腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用板熊，例如表觀遺傳免疫編輯驅(qū)動(dòng)獲得性免疫入侵程序，導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中出現(xiàn)空間異質(zhì)性景觀察绷。因此干签，將空間水平上的多組學(xué)信息進(jìn)行整合有助于破譯膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控和動(dòng)態(tài)適應(yīng)的原因。
RESULTS
Atlas of spatially resolved transcriptomics in glioblastoma
從28個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）樣本獲取了88793個(gè)跨越不同年齡組和解剖區(qū)域的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜（stRNA-seq）拆撼，并補(bǔ)充了空間代謝組學(xué)（基質(zhì)輔助激光解析電離, MALDI）和蛋白組學(xué)（成像質(zhì)譜流式容劳，IMS）的分析數(shù)據(jù)（下圖）。
為了解決空間轉(zhuǎn)錄組的精度問題闸度，文章提到了兩種方式：
-
（1）a machine-learning-based segmentation technique to predict the exact number of nuclei within each spot
識(shí)別每個(gè)spot的細(xì)胞數(shù) (2) an artificial neural network (ANN) model trained to predict the number of tumor cells per spot, based on a simulated dataset consisting of randomized
cellular assemblies from paired st-/scRNA-seq datasets (n = 5)(也是我們常用的方法)
為了使結(jié)果與組織學(xué)分類的普遍黃金標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合竭贩，根據(jù)常春藤 GAP 組織學(xué)分類系統(tǒng)預(yù)測了逐spot組織學(xué)表型（這樣的工作常人真的是難以完成）
Deciphering spatially resolved transcriptional heterogeneity
研究的目標(biāo)是通過將它們與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄和組織學(xué)分類聯(lián)系起來來識(shí)別重復(fù)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄空間模式（也因此取樣的時(shí)候含有腫瘤細(xì)胞少的spot全部去除）留量。GBM transcriptional subgroups 的空間定位，如最初使用 bulk RNA-seq 描述并使用 scRNA-seq 進(jìn)一步表征哟冬，仍不清楚楼熄。我們和其他研究者人為transcriptional subgroups在空間上是分離的，并在腫瘤內(nèi)行使不同的功能柒傻。為了解決空間上的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性孝赫，首先必須解決的就是空間表達(dá)模式，再將這些結(jié)果匯總到整個(gè)隊(duì)列中红符。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)青柄，依次消除了混雜因素，包括患者間變異性预侯、技術(shù)偽影和測序深度的變異性致开。隨后整合了患者空間加權(quán)相關(guān)矩陣（逐個(gè)聚類），然后是層次聚類萎馅，確認(rèn)了五個(gè)重復(fù)的空間不同轉(zhuǎn)錄程序的空間分離双戳。這種方法使作者能夠了解在整個(gè)隊(duì)列中穩(wěn)健表達(dá)的患者特異性簇中轉(zhuǎn)錄程序的生物學(xué)意義。其中糜芳，在90%的樣本中都包含5個(gè)一致表達(dá)的轉(zhuǎn)錄程序飒货，分別為與缺氧反應(yīng)和糖酵解基因相關(guān)、以少突膠質(zhì)細(xì)胞特征為標(biāo)志峭竣、富集放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或炎癥相關(guān)基因塘辅，以及以神經(jīng)發(fā)育為特征的類群。
識(shí)別空間轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄程序主要分為以下三個(gè)步驟：
- identification of patientwise robust regional transcriptional programs
- horizontal integration across patients using shared transcriptional programs as anchors and spatially weighted correlation to explore colocalization of transcriptional programs
- characterization of the spatial organization of shared programs
空間上不同的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)獨(dú)立于細(xì)胞周期狀態(tài)皆撩，并且與現(xiàn)有的分類系統(tǒng)一致
空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序和亞克隆結(jié)構(gòu)
拷貝數(shù)改變（CNAs）扣墩，包括癌基因的局部擴(kuò)增或腫瘤抑制因子的丟失哲银，是惡性細(xì)胞的標(biāo)志，而CNAs與特定細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)聯(lián)呻惕，在缺氧反應(yīng)類別中荆责，確定了作為獨(dú)立亞克隆事件發(fā)生的CNAs的顯著積累。利用推斷的 CNA 研究了基因組改變和空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序之間的關(guān)系
作者進(jìn)一步研究空間上不同的轉(zhuǎn)錄多樣性是否可以直接反映腫瘤內(nèi)的遺傳亞克隆亚脆。作者通過 CNA 的患者特異性層次聚類重建了克隆體系結(jié)構(gòu)做院。鑒定了 57 個(gè)遺傳亞克隆，每個(gè)樣本跨越 2 到 6 個(gè)亞克隆型酥。然后山憨，作者確定了每個(gè)亞克隆中個(gè)體、空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序的分布弥喉。分析表明郁竟，在 26.32% 的所有亞克隆中，單一轉(zhuǎn)錄程序占主導(dǎo)地位由境。這些發(fā)現(xiàn)得出結(jié)論棚亩，盡管亞克隆偶爾偏向于空間 OPC (8.77%) 或反應(yīng)性缺氧程序 (10.52%)，但克隆結(jié)構(gòu)對空間不同轉(zhuǎn)錄程序的發(fā)生影響有限虏杰。
GBM中與反應(yīng)性缺氧程序相關(guān)的代謝改變（關(guān)于空間代謝組學(xué)讥蟆，我目前仍然是一片空白）
為了進(jìn)一步探索空間上不同的反應(yīng)性缺氧模式，作者使用空間代謝組學(xué)技術(shù)從連續(xù)用于 stRNA-seq 的組織切片（患者纺阔，n = 6) 瘸彤。實(shí)施了一個(gè)類似于 stRNA-seq代謝譜的工作流程，降維揭示了前兩個(gè)主要成分中的主要差異笛钝，從而確定了三個(gè)顯著的代謝亞組后校正集群穩(wěn)定性质况。功能代謝分析顯示在第一代謝模塊（M-G1）磷酸戊糖途徑顯著富集。第二個(gè)代謝亞組（M-G2）的特征是磷酸腺苷酸代謝富集玻靡。最終的代謝亞組（M-G3）在糖酵解和氨基糖代謝方面高度富集结榄。
針對空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序反應(yīng)性缺氧，在作者的綜合分析（WNN 聚類）中作為一個(gè)獨(dú)特的簇出現(xiàn)囤捻。組織學(xué)上臼朗，分配給反應(yīng)性缺氧程序的大多數(shù)斑點(diǎn)代表壞死邊緣。作者假設(shè)低氧代謝導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性在空間隔離的生態(tài)位中積累蝎土。這些“反應(yīng)島”代表了從頭的潛在來源基因組改變有助于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生治療抗性视哑。
進(jìn)一步探索富含反應(yīng)性缺氧特征的區(qū)域。區(qū)域被定義為缺氧核心誊涯，并富集糖酵解途徑黎炉。還顯示出多條染色體（8p、9p醋拧、13q、19q 和 21q）的獨(dú)特?fù)p失和增加，這種變異最有可能由缺氧核心區(qū)域內(nèi)的單個(gè)亞克隆解釋丹壕，這證明了缺氧相關(guān)代謝是一種潛在的假設(shè)基因組不穩(wěn)定性的驅(qū)動(dòng)因素庆械。
反應(yīng)性缺氧區(qū)域積累染色體改變
作者分析了來自 TCGA 數(shù)據(jù)庫的樣本（患者 GBM IDH1/2野生型 n = 357），根據(jù)患者的缺氧基因表達(dá)評分對患者進(jìn)行分類菌赖。缺氧驅(qū)動(dòng)的腫瘤顯示染色體改變顯著增加缭乘，證實(shí)了代謝和基因組不穩(wěn)定性之間的關(guān)系。結(jié)果主要表明琉用，低氧/氧化應(yīng)激增強(qiáng)了基因組的不穩(wěn)定性堕绩，有助于在亞克隆選擇的支持下加強(qiáng) GBM 的微進(jìn)化以恢復(fù)彈性。為了通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證作者的假設(shè)邑时，作者在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)原發(fā)性患者來源的GBM 細(xì)胞系2-6 周（患者 n = 4）奴紧。拷貝數(shù)變異揭示了 CNA 譜的差異，在慢性缺氧條件下 CNA 事件的顯著積累證實(shí)了壓力誘導(dǎo)的 CNA 改變的假設(shè)晶丘。
作者通過分析常氧和缺氧條件下CpG 位點(diǎn)cg12434587 和 cg12981137處的 O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 (MGMT) 啟動(dòng)子甲基化來探索缺氧代謝對DNA 甲基化的影響黍氮。細(xì)胞系當(dāng)暴露于缺氧時(shí)，在常氧下具有未甲基化的 MGMT 啟動(dòng)子會(huì)產(chǎn)生高甲基化浅浮。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步加強(qiáng)了關(guān)于代謝驅(qū)動(dòng)的 CNA 的假設(shè)沫浆，其中大多數(shù)從頭重排必須被視為隨機(jī)事件，有助于腫瘤的亞克隆進(jìn)化滚秩。
低氧代謝調(diào)節(jié)GBM中的“去或成長”潛力
在對空間分辨轉(zhuǎn)錄程序的初步表征中专执，反應(yīng)性缺氧程序在非循環(huán)細(xì)胞中顯著富集。表明缺氧應(yīng)激會(huì)觸發(fā)細(xì)胞周期停滯郁油，特別是 S 期停滯本股。導(dǎo)致假設(shè)缺氧驅(qū)動(dòng)的 S 期停滯有助于基因組不穩(wěn)定性的積累。
GBM 細(xì)胞的基線轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可以分配給“發(fā)育”（AC-已艰、OPC-或 NPC 樣）程序痊末。在空間上，代謝譜顯示磷酸戊糖途徑 (PPP) 的富集哩掺。由于增殖和腫瘤生長凿叠，會(huì)發(fā)生越來越多的營養(yǎng)和氧氣缺乏，迫使采用代謝程序進(jìn)行糖酵解嚼吞。這種現(xiàn)象是 PPP 和糖酵解之間的相互轉(zhuǎn)換盒件，與腫瘤細(xì)胞的生長或生長潛力有關(guān)，表明 PPP 支配著由生長的腫瘤細(xì)胞組成的區(qū)域舱禽。
當(dāng)缺氧發(fā)生時(shí)炒刁，這種低氧誘導(dǎo)的糖酵解轉(zhuǎn)換隨后的誘導(dǎo)，這有助于細(xì)胞逃逸/遷移到含氧量正常的區(qū)域誊稚。由于在缺氧條件下發(fā)生的細(xì)胞周期程序的下調(diào)翔始，會(huì)發(fā)生 S 期停滯罗心，導(dǎo)致隨后從頭CNA 的積累。作者假設(shè)這些受缺氧影響的細(xì)胞中有很大一部分隨后進(jìn)入凋亡狀態(tài)城瞎，導(dǎo)致在 GBM 中看到的特征性壞死渤闷。只有一小部分細(xì)胞通過遷移相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序的上調(diào)成功逃脫。除缺氧外脖镀，據(jù)報(bào)道飒箭，其他壓力源（如放射或化療）會(huì)導(dǎo)致 GBM 出現(xiàn)這種與壓力相關(guān)的擾動(dòng)。
根據(jù)這個(gè)模型蜒灰，可以看到低氧代謝和細(xì)胞遷移之間的反比關(guān)系弦蹂。為了探索代謝改變區(qū)域中遷移基因表達(dá)特征的富集，作者確定了特定基因表達(dá)特征的低富集和高富集之間的定向梯度的空間方向强窖。每個(gè)點(diǎn)的方向向量是基于其局部鄰域中所研究的基因表達(dá)特征的分級富集凸椿。這些向量場計(jì)算使作者能夠近似空間基因表達(dá)軌跡，從而能夠識(shí)別空間上相反的轉(zhuǎn)錄途徑毕骡∠鞫基于這些矢量場計(jì)算，作者報(bào)告缺氧響應(yīng)和遷移特征顯示反向空間軌跡未巫×耍總之，作者的研究結(jié)果為代謝變化和氧化應(yīng)激是基因組多樣性的潛在互惠驅(qū)動(dòng)因素提供了證據(jù)叙凡，從而導(dǎo)致 GBM 中的克隆進(jìn)化劈伴。
探索反應(yīng)性免疫區(qū)域的腫瘤-宿主相互依賴性
通過選擇反應(yīng)性免疫和反應(yīng)性缺氧計(jì)劃區(qū)域內(nèi)的 ROI，并從分類為神經(jīng)元分化的區(qū)域中控制 ROI握爷。得到分割后 82,179 個(gè)細(xì)胞的綜合蛋白質(zhì)組圖（空間白蛋白組學(xué)）跛璧。
作者的分析顯示骨髓細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞在歸類為反應(yīng)性免疫的區(qū)域中。為了研究免疫富集區(qū)域的腫瘤細(xì)胞分化新啼，作者通過將細(xì)胞細(xì)分為放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（EGFR + HOPX +）追城、反應(yīng)性免疫（EGFR + CHI3L1 + VIM +）、空間 OPC（EGFR + OLIG1 + )燥撞、神經(jīng)發(fā)育(EGFR + SNAP25 + CALM2 + ) 和反應(yīng)性缺氧 (EGFR + VEGFA + )座柱。反應(yīng)性免疫（EGFR）的獨(dú)家富集+ CHI3L1 + VIM + ) 細(xì)胞僅在轉(zhuǎn)錄定義的反應(yīng)性免疫定位中得到證實(shí)。
為了補(bǔ)充關(guān)于免疫系統(tǒng)和 GBM 之間細(xì)胞關(guān)系的發(fā)現(xiàn)物舒，作者根據(jù)腫瘤細(xì)胞與淋巴或骨髓細(xì)胞之間的距離量化了它們之間的細(xì)胞連接性 色洞，證實(shí)了腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)錄定義的反應(yīng)性免疫區(qū)域中的免疫區(qū)室之間的細(xì)胞相互作用增強(qiáng)。接下來冠胯，作者探索了不同 ROI 中細(xì)胞類型的分布火诸。作者證實(shí)了在反應(yīng)性免疫和缺氧中疑似富集 AC 和 MES 樣細(xì)胞。OPC 樣細(xì)胞主要富集于神經(jīng)發(fā)育ROI荠察。此外置蜀，反應(yīng)性免疫和缺氧區(qū)域均顯示腫瘤相關(guān)骨髓細(xì)胞 (TAM) 和 T 細(xì)胞的顯著富集奈搜。
鑒于 T 細(xì)胞在兩個(gè)反應(yīng)區(qū)域都富集，作者研究了 T 細(xì)胞上的平均PD-1 蛋白水平 (CD3+ )盯荤，與反應(yīng)性缺氧和神經(jīng)發(fā)育相比媚污，反應(yīng)性免疫區(qū)域內(nèi)顯著增加，表明反應(yīng)性免疫 ROI 中的局部免疫抑制增強(qiáng)廷雅。此外，代表 GBM 免疫景觀的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集證實(shí)了腫瘤反應(yīng)性免疫區(qū)域中記憶和耗盡的 T 細(xì)胞的富集
環(huán)境條件有助于雙向亞型轉(zhuǎn)變
雖然已有大量研究表明炎癥環(huán)境驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)路適應(yīng)從而導(dǎo)致GBM異質(zhì)性京髓，但是尚不清楚這種轉(zhuǎn)變是否可逆航缀，如果將微環(huán)境引起轉(zhuǎn)錄重編程的腫瘤細(xì)胞重新暴露于健康大腦會(huì)發(fā)生多大程度的變化呢。于是研究人員將MES樣原發(fā)性患者衍生細(xì)胞接種到培養(yǎng)4天的來自不同年齡的多個(gè)人類和大鼠供體的皮層組織切片中堰怨，通過scRNA-seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析芥玉。在中青年人類供體中，OPC-备图、AC-和NPC樣細(xì)胞顯著增多灿巧，而老年供體中MES樣/反應(yīng)性細(xì)胞類型顯著增多，在嚙齒類工體環(huán)境中培養(yǎng)的GBM細(xì)胞表現(xiàn)出MES和AC樣轉(zhuǎn)錄特征的富集揽涮，說明宿主環(huán)境在重塑轉(zhuǎn)錄程序方面發(fā)揮重要作用抠藕。
討論
在過去幾年中，通過單細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)步取得的眾多發(fā)現(xiàn)徹底改變了對腫瘤異質(zhì)性和可塑性以及潛在治療選擇的理解蒋困。然而盾似，尚未研究腦腫瘤空間組織的重要性。在這里雪标，作者揭示了微環(huán)境與GBM轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的時(shí)空變化之間的雙向和單向相互作用的見解零院。揭示了五個(gè)空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序的存在，這些轉(zhuǎn)錄程序以共享的轉(zhuǎn)錄特征和專有的基因組改變?yōu)闃?biāo)志村刨。盡管在 GBM 中有 CNA 的先前描述告抄，但以前沒有報(bào)道過區(qū)域模式和與轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)聯(lián)。并對對細(xì)胞狀態(tài)嵌牺、組織學(xué)模式和空間專有轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行整體比較打洼。
這種以空間分辨方式在各種分子水平上全面表征 GBM 有助于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)適應(yīng)及其在腫瘤微環(huán)境中的空間關(guān)系。作者數(shù)據(jù)表明髓梅，在 S 期停止后拟蜻，嚴(yán)重缺氧等代謝改變會(huì)導(dǎo)致增殖受損，從而導(dǎo)致 CNA 的顯著積累枯饿。這種現(xiàn)象已在其他癌癥類型中報(bào)道酝锅，并且存在足夠的證據(jù)詳細(xì)說明缺氧條件下基因組不穩(wěn)定性的增加。作者在 2D 細(xì)胞培養(yǎng)和 TCGA 數(shù)據(jù)中的結(jié)果和驗(yàn)證表明奢方，區(qū)域缺氧代謝代表了基因組不穩(wěn)定性的潛在儲(chǔ)存庫搔扁，并代表了微進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)因素爸舒，從而使耐藥表型的進(jìn)化成為可能。
Method
我們主要來關(guān)注一下空間的CNV估計(jì)
關(guān)于SPATA稿蹲，大家可以參考文章SPATA
CNV分?jǐn)?shù)矩陣的聚類扭勉，inferCNV選擇subcluster模式會(huì)進(jìn)行層次聚類。
生活很好苛聘，有你更好
