作者可训，Evil Genius
單細(xì)胞分析流程
今日的參考文章在Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma, 2024年4月22號發(fā)表于cell昌妹。
膠質(zhì)瘤包含不同狀態(tài)的惡性細(xì)胞。
結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)握截、空間蛋白質(zhì)組學(xué)和計算方法來定義膠質(zhì)瘤細(xì)胞狀態(tài)并揭示它們的組織飞崖。
大腦腫瘤的微觀結(jié)構(gòu)是無限變化的，然而在它們千變?nèi)f化的外觀中谨胞，某些相似性結(jié)構(gòu)可以被追蹤到固歪。膠質(zhì)瘤通常是高度異質(zhì)性和浸潤性的，但特定的空間模式廣泛地被注意到胯努。
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBMs)的復(fù)發(fā)性空間結(jié)構(gòu):膠質(zhì)瘤細(xì)胞依賴或模仿大腦原有的正常結(jié)構(gòu)牢裳，具有侵襲性的有組織的繼發(fā)結(jié)構(gòu);癌細(xì)胞的無定形排列;癌細(xì)胞形成的模式不依賴于先前存在的正常結(jié)構(gòu)的適當(dāng)結(jié)構(gòu);壞死區(qū)域周圍有間充質(zhì)組織反應(yīng)。因此叶沛，壞死灶(和缺氧)以及正常大腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)周圍的區(qū)域與局部組織有關(guān)贰健，而在這些區(qū)域之外，膠質(zhì)瘤組織以缺乏組織學(xué)組織為主恬汁。
scRNA、CODEX辜伟、Visium氓侧。
局部腫瘤微環(huán)境(TME)是癌細(xì)胞狀態(tài)的主要決定因素。
1导狡、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)
使用兩種初始方法對spot進(jìn)行分類和標(biāo)注约巷。首先，通過平均每個染色體區(qū)域的基因表達(dá)來進(jìn)行拷貝數(shù)畸變(CNA)推斷旱捧，將spot分類為惡性独郎，非惡性或混合spot踩麦。其次，采用Leiden聚類方法對每個樣本進(jìn)行聚類氓癌，并在多個切片的情況下對每個腫瘤進(jìn)行聚類谓谦，并通過基因集富集分析對聚類進(jìn)行注釋。當(dāng)單樣本Leiden聚類將樣本中相似成分的spot組合在一起時贪婉，下一步的目標(biāo)是更好地捕捉細(xì)胞狀態(tài)的連續(xù)性質(zhì)反粥。為此，對每個樣本進(jìn)行了非負(fù)矩陣分解(NMF)疲迂，并推導(dǎo)出穩(wěn)定表達(dá)program才顿。
Experimental design and spot classification per sample
Segmentation, CNA inference, and per-sample clustering
2、膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)表達(dá)異質(zhì)性
比較了通過Leiden聚類和NMF在單個GBM樣本中鑒定的492個基因表達(dá)跑program尤蒿。
spot的表達(dá)譜反映了不同細(xì)胞狀態(tài)的組合
Deriving and annotating spatial metaprograms
Validation and further analysis of spatial metaprograms
Mapping spatial metaprograms to cell states
3郑气、空間蛋白質(zhì)組學(xué)作為膠質(zhì)瘤圖譜的補充
雖然Visium覆蓋整個組織，但它的空間分辨率較低腰池，不適合捕獲罕見或空間分散的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)尾组。因此，使用CODEX作為補充方法巩螃，在真正的單細(xì)胞蛋白水平上驗證分析結(jié)果演怎。40個標(biāo)記抗體panel是基于單細(xì)胞GBM MPs和標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記設(shè)計的，幾乎涵蓋了所有相關(guān)的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)避乏。
對單細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行聚類,為了能夠直接比較CODEX和Visium數(shù)據(jù)爷耀，使用STalign對兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行空間對齊。在Visium數(shù)據(jù)中拍皮，一些細(xì)胞類型和狀態(tài)無法通過無監(jiān)督分析檢測到歹叮，因為它們傾向于代表它們所在spot的一小部分。例如T細(xì)胞和B細(xì)胞很少占主導(dǎo)地位铆帽，它們的低mRNA含量進(jìn)一步限制了它們的信號咆耿，因此無法通過無監(jiān)督分析識別T細(xì)胞或B細(xì)胞MPs（對于Visium）。
CODEX數(shù)據(jù)能夠評估每個state的細(xì)胞密度爹橱。非惡性腦細(xì)胞類型的密度(平均5個細(xì)胞/spot)低于惡性細(xì)胞萨螺、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(平均9個細(xì)胞/spot)。在惡性狀態(tài)中愧驱，染色質(zhì)- REG和MES樣密度最大慰技，NPC樣、OPC樣和AC樣密度最小组砚。
Spatial profiling of gliomas by CODEX
GBM profiling by CODEX
4吻商、GBM腫瘤包含共同發(fā)生的結(jié)構(gòu)化和非組織化區(qū)域
每個樣本中相鄰spot和分散spot的細(xì)胞狀態(tài)豐富程度，即“空間相關(guān)性”糟红“剩空間相關(guān)性因樣本而異乌叶，例如在一些樣本(“結(jié)構(gòu)化”)中，大多數(shù)狀態(tài)往往具有高相關(guān)性柒爸，而在其他樣本(“無組織”)中准浴，大多數(shù)狀態(tài)往往具有低相關(guān)性。
根據(jù)其局部環(huán)境的一致性將每個點分類為屬于結(jié)構(gòu)化揍鸟，無組織或中間區(qū)域兄裂。結(jié)合(CNA分?jǐn)?shù))進(jìn)一步細(xì)分結(jié)構(gòu)化和無組織區(qū)域，對空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行定義阳藻。
Spatial distribution of cell states and organization zones
Association between spatial coherence and MES-Hyp
Spatial coherence and organizational zones
5晰奖、癌細(xì)胞狀態(tài)的空間組織與MES-Hyp（缺氧類的間質(zhì)細(xì)胞）豐度有關(guān)
MES-Hyp在Struct-Malig（惡性）區(qū)富集。即使從空間相關(guān)性計算中去除MES-Hyp spot腥泥，富含MES-Hyp的樣品仍具有較高的空間相關(guān)性匾南。因此，與缺氧相關(guān)的組織增加超出了缺氧癌細(xì)胞狀態(tài)本身蛔外，靠近MES-Hyp spot的所有惡性細(xì)胞狀態(tài)都比缺乏MES-Hyp spot的相同細(xì)胞狀態(tài)更有組織蛆楞。因此，缺氧周圍的結(jié)構(gòu)區(qū)明顯比與缺氧相關(guān)的兩種組織學(xué)注釋——pseudopalisading and necrosis (PAN) and MVP更為多樣夹厌。雖然神經(jīng)元spot在空間上也是高度連貫的豹爹，但在含有神經(jīng)元的區(qū)域中沒有觀察到這種擴(kuò)展結(jié)構(gòu)對相鄰細(xì)胞狀態(tài)的影響。因此矛纹，缺氧可能提供了一種外在的力量棘伴，在大的組織區(qū)域上賦予了表達(dá)狀態(tài)的結(jié)構(gòu)連續(xù)體螃诅，從而形成了一個已知的局部結(jié)構(gòu)步鉴，通過組織學(xué)可以看到肴敛，而一個以前未被發(fā)現(xiàn)的遠(yuǎn)程結(jié)構(gòu)可以通過細(xì)胞狀態(tài)的分子譜檢測到。在GBM和IDH突變的膠質(zhì)瘤中采够，非缺氧區(qū)在很大程度上是disorganized(Disorg-Malig)肄方，這與組織學(xué)上看到的膠質(zhì)瘤的整體disorganization一致。
如果缺氧是空間組織的驅(qū)動因素蹬癌，那么將無序的GBM類器官置于缺氧條件下可能會誘導(dǎo)癌細(xì)胞狀態(tài)的組織权她，實驗表明完全的狀態(tài)轉(zhuǎn)變可能需要長期暴露于缺氧和/或壞死、免疫細(xì)胞和血管逝薪。此外伴奥，類器官模型研究包含核心惡性GBM細(xì)胞狀態(tài)，但它并沒有穩(wěn)定地再現(xiàn)人類腫瘤樣本的空間組織翼闽，即使在含有MES-Hyp的對照類器官中也是如此。
6洲炊、Pairwise state-state spatial associations recur across samples and scales
為了量化細(xì)胞狀態(tài)之間的空間關(guān)系感局，設(shè)計了三個互補的度量尼啡，突出了不同分辨率水平下的狀態(tài)耦合。首先询微，兩種狀態(tài)的區(qū)域組成崖瞭，定義為它們在預(yù)定義半徑(用r表示)的六邊形窗口上的豐度之間的相關(guān)性。其次撑毛，兩種細(xì)胞狀態(tài)之間的鄰接性书聚，定義為一種狀態(tài)在另一種狀態(tài)的直接鄰近spot上的富集。第三藻雌，同一region內(nèi)兩個state的共定位雌续。分析觀察到在大范圍的區(qū)域中狀態(tài)關(guān)系的總體一致性，同時在考慮所有measures時也確定了特定的scale-dependent shifts(distance-dependent coupling)(結(jié)構(gòu)化region的measures之間的一致性為67%胯杭，無組織region的measures之間的一致性為57%)驯杜。
從區(qū)域組成上看，結(jié)構(gòu)化和無序區(qū)域具有相似數(shù)量的顯著空間關(guān)聯(lián)做个，且這些關(guān)聯(lián)在很大程度上是一致的鸽心，而共定位和鄰接度量主要識別結(jié)構(gòu)化區(qū)域特有的相互作用。因此居暖，即使在沒有由鄰近細(xì)胞或spot定義的直接空間格局的情況下顽频，區(qū)域組成也趨于保持。接下來就是要分析細(xì)胞間的共定位太闺。
Spatial associations between states across scales
Spatial relationship analysis
7糯景、結(jié)構(gòu)化區(qū)域GBM空間組織的分層模型
為了檢驗上述細(xì)胞間相互作用是否可以組合形成一個高階組織，分析生成了一個網(wǎng)絡(luò)圖跟束，其中node代表狀態(tài)莺奸，edge代表共識相互作用。該圖顯示了一個五層組織冀宴，其中dege只存在于同一層內(nèi)或相鄰層之間灭贷。這種組織似乎以缺氧梯度為主，第一層由MES-Hyp (L1:核心缺氧/壞死)組成略贮，其次是第二層由MES-Ast甚疟、MES-like和inflammaty - mac (L2:缺氧相關(guān))組成。第三層包括可能有助于解決缺氧的免疫和血管生成相關(guān)的細(xì)胞類型和狀態(tài)逃延，包括Vasc览妖、Mac和增殖- metab (L3:血管生成反應(yīng)/免疫中樞)。L3后揽祥，缺氧可能被解決讽膏，使得神經(jīng)發(fā)育惡性狀態(tài)的存在可能更加依賴氧氣- AC-like，OPC-like和NPC-like(L4:惡性神經(jīng)發(fā)育狀態(tài))拄丰。最后府树，非惡性腦細(xì)胞類型(反應(yīng)性AST俐末、寡糖和神經(jīng)元)反映了向浸潤腦實質(zhì)(L5:腦實質(zhì))的轉(zhuǎn)變。將spot映射到五層保留了結(jié)構(gòu)化和無組織區(qū)域之間的區(qū)別奄侠。CODEX數(shù)據(jù)在L3(血管生成反應(yīng)/免疫中樞)中添加B細(xì)胞和T細(xì)胞后生成了類似的結(jié)構(gòu)卓箫。
為了更好地理解我們的層模型，將樣本分配到五個結(jié)構(gòu)垄潮，并與神經(jīng)病理學(xué)家的組織病理學(xué)注釋和來自組織病理學(xué)特征的IVY Gap轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行了比較烹卒。研究發(fā)現(xiàn)模型與經(jīng)典注釋高度一致，L1類似于PAN, L3類似于MVP, L4類似于細(xì)胞腫瘤弯洗，L5類似于前沿旅急。值得注意的是，缺氧鄰近層(L2)和局部缺氧的小區(qū)域不能通過經(jīng)典的組織病理學(xué)或IVY Gap轉(zhuǎn)錄程序來區(qū)分涂召。同樣坠非，將來自五層的轉(zhuǎn)錄特征與對應(yīng)于顯微解剖組織病理學(xué)特征的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行比較，除了L2不能直接映射到組織病理學(xué)特征外果正，總體上是一致的炎码。因此，通過對基因表達(dá)的無監(jiān)督分析秋泳，在很大程度上趨同于膠質(zhì)瘤的主要組織學(xué)特征潦闲，但準(zhǔn)確性提高了，并增加了一個新的低氧鄰近狀態(tài)層(L2)迫皱。此外歉闰，可以在細(xì)胞狀態(tài)的詳細(xì)分辨率上重新定義經(jīng)典的組織病理學(xué)特征。
A layered model of GBM spatial organization
GBM state layers
結(jié)合Visium與CODEX和計算方法來定義膠質(zhì)瘤的組織卓起。
具有有限空間聚類的細(xì)胞狀態(tài)信號被Visium稀釋和敬，可能無法通過無監(jiān)督分析檢測到，如細(xì)胞周期和低豐度細(xì)胞類型(如T細(xì)胞)的情況戏阅。
研究發(fā)現(xiàn)了三種空間組織模式昼弟。首先，細(xì)胞傾向于被處于相同狀態(tài)的其他細(xì)胞所包圍(特定狀態(tài)的cluster)奕筐，形成了高度富集的個體狀態(tài)的局部環(huán)境舱痘。這種模式可以從每個spot內(nèi)相似細(xì)胞的聚類以及分配給同一MP的spot的聚類來證明。這種聚類表明空間位置在調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)中起著核心作用离赫。
最后更新一個小內(nèi)容芭逝，就是關(guān)于單細(xì)胞空間突變信息分析導(dǎo)論提到的突變信息，那么如何知道單細(xì)胞空間檢測到的時候是熱點突變位點渊胸，大家可以參考cancer hotspots,網(wǎng)址在http://www.cancerhotspots.org/#/home旬盯。
