基礎(chǔ)知識系列鏈接（節(jié)選）：
CRISPR-Cas9學(xué)習(xí)筆記
Cre-LoxP條件性基因編輯系統(tǒng)--學(xué)習(xí)筆記
FLP-FRT系統(tǒng)--誘導(dǎo)性基因編輯inducible gene editing
系列實驗鏈接：
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA設(shè)計
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設(shè)計好之后
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 1
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 2
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 3
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 4
這里我不再放詳細(xì)的實驗步驟了棺妓，因為我的實驗記錄本已經(jīng)詳細(xì)的記錄了實驗步驟和條件嗅义，沒有多余的時間再重新弄一個掀宋，可以自行回去查找文獻(xiàn)對照protocol
上次我的day 4做完之后俺祠，接著就要轉(zhuǎn)293T細(xì)胞來驗證一下質(zhì)粒的效果了辫樱。簡單描述以下前期的思路（其實是我自己在回顧）杀怠，先準(zhǔn)備好需要用的東西：Cas9 backbone質(zhì)粒母截，根據(jù)基因靶點(diǎn)將sgRNA設(shè)計好（順帶設(shè)計一下引物）惜互，將sgRNA插入到Cas9 backone質(zhì)粒中蹋订，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增率挣，提取質(zhì)粒后酶切驗證。接著就是293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗證了露戒。
其實就是簡單的瞬時轉(zhuǎn)染
使用常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000或者羅氏等其他公司的轉(zhuǎn)染試劑椒功，按照protocol嚴(yán)格操作即可。
1. 注意293T細(xì)胞非常脆弱智什，動作要輕柔动漾。
2. 但我為啥做了10天呢。撩鹿。谦炬。293T細(xì)胞是非常好轉(zhuǎn)的細(xì)胞，可是我仍然做了好一段時間才達(dá)到了所需的轉(zhuǎn)染效率节沦，這跟轉(zhuǎn)染試劑的效率有關(guān)键思。盡量使用新開封的試劑。
3. 另外293T細(xì)胞的狀態(tài)也很重要甫贯。
4. 細(xì)胞融合度：如果按照protocol吼鳞，在轉(zhuǎn)染當(dāng)天70-90的細(xì)胞融合度，那就妥妥的12小時之后就長爆了叫搁，根本沒法在孔板里面待夠72小時赔桌。細(xì)胞一旦超過50%之后就快速增殖了供炎，因此我選擇了45%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24-48 h細(xì)胞并不是非常的滿疾党，72 h細(xì)胞還是OK的音诫。
昨天和今天都提取了基因組DNA，就醬紫雪位。
感謝師兄DZ
