今兒來了解測序的來龍去脈
一.下面說一下測序技術的來源和特點
（引自：歐易生物https://mp.weixin.qq.com/s/_ZqUcgq-qTDlKXw8NHwsNA）
一代測序技術簡介
一代測序技術，也被稱為Sanger測序，由一個叫Sanger的人發(fā)明的一種測序方式。其利用了雙脫氧核苷酸會終止PCR的原理千劈。比如：一條序列為ATCGCTA讨惩，我們進行3次的雙脫氧核苷酸墓阀，第一次加入雙脫氧核苷酸A和正常的ATCG那么我們會得到下面兩種序列禾乘，A惋耙、ATCGCTA乱陡。那么我們就知道堿基A在序列的第一個堿基和第7個堿基浇揩。同理運用雙氧核苷酸T和C，就會得整個序列的對應堿基的位置BP信息蛋褥。進而得到整條序列的ATCG的序列信息临燃。
一代測序的特點：速度快，但是一次只能測一條單一的序列（所以叫低通量）烙心，且最長也就能測1000-1500bp膜廊。所以被廣泛應用在單序列測序上。簡單概括就是淫茵，一代測序只能測一條長度在1000bp左右的序列
當要多條測序時候爪瓜，就費勁了，于是二代測序就應運而生
二代測序
二代測序技術匙瘪，也被稱為高通量測序技術铆铆。它解決了一代測序只能測一條序列的缺陷。
之所以稱其為高通量測序就是因為它一次能夠同時測很多的序列丹喻。比如薄货，當我們分析一個物種或樣本中的所有序列信息時候，就用得上高通量
我們通過物理或是化學的方式將DNA隨機打斷成無數(shù)的小片段（250-300bp）碍论，之后通過建庫富集了這些DNA片段谅猾。接下來將建完的庫放入測序儀中測序，測序儀中有著可以讓DNA片段附著的區(qū)域鳍悠，每一個片段都有獨立的附著區(qū)域税娜，這樣測序儀可以一次檢測所有附著的DNA序列信息。最后通過生物信息學分析將小片段拼接成長片段藏研。
二代測序特點：一次能夠測大量的序列敬矩，但是片段被限制在了250-300bp，由于是通過序列的重疊區(qū)域進行拼接蠢挡，所以有些序列可能被測了好多次弧岳。
由于建庫中利用了PCR富集序列凳忙，因此有一些量少的序列可能無法被大量擴增，造成一些信息的丟失缩筛，且PCR中有概率會引入錯配堿基消略。所以三代測序就這樣誕生了堡称。
三代測序
三代測序其實就是對二代測序的一個升級瞎抛，簡單來說就是它同樣一次能測好多序列，但是測序的長度達到了10kb左右却紧，并且不需要PCR富集序列桐臊，直接測序，這就解決了信息的丟失晓殊，以及堿基錯配的問題断凶。但目前來說三代測序依然有一定的缺陷：三代測序技術依賴DNA聚合酶的活性，且成本很高巫俺，目前的錯誤率在15%-40%认烁，極大地高于二代測序技術的錯誤率不過好在三代的錯誤是完全隨機發(fā)生的，可以靠覆蓋度來糾錯（但這要增加測序成本）介汹。
簡潔明了舉例說一下這三代的特點
任務：做1000張試卷却嗡。
一代測序：一個人一次只能做50張試卷，所以他無法做完這1000張嘹承。
二代測序：有500個人窗价，每個人一次只能做10張試卷，且每個人隨機做這1000張中的10張試卷叹卷，最后匯總這500個人做的試卷撼港，去除重復做的把不同的統(tǒng)一起來，這樣可以最大限度得完成1000張試卷骤竹。
三代測序：有30人帝牡，每個人一次能做100張試卷，之后的和二代一樣蒙揣，匯總結果靶溜。
二.測序的技術原理
一代測序
核心原理：雙脫氧終止反應法，聚合酶延伸鏈
步驟：
1.添加反應物：分別加入引物鸣奔、DNA聚合酶墨技、四種dNTP、一定比例的ddNTP（帶有熒光標記）（例如ddATP挎狸，它就負責測定T堿基的位置）
2.之后大批量的核苷酸反反復復的結合扣汪，把所有的位點都結合
3.最后利用凝膠電泳和放射自顯影只能看到帶有熒光標記的ddNTP，先利用電泳條帶前后關系確定下他們的排列順序
4.再用ATCG關系反轉一下锨匆，即可得到序列
一代測序
二代測序(NGS)
第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)崭别，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列
步驟：
(1) DNA待測文庫構建
利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段冬筒，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段茅主，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭舞痰，構建出單鏈DNA文庫
（2）Flowcell
Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，當文庫建好后诀姚，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上响牛。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭赫段，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因）呀打，并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增
（3）橋式PCR擴增與變性
橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增糯笙，如圖3.a所示贬丛。經(jīng)過不斷的擴增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束给涕，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝豺憔，進行這一過程的目的在于實現(xiàn)將堿基的信號強度放大，以達到測序所需的信號要求够庙。
（4）測序
測序方法采用邊合成邊測序的方法恭应。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP（如同Sanger測序法）首启。這些dNTP的3’-OH被化學方法所保護暮屡，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后毅桃，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉褒纲。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液钥飞，用激光激發(fā)熒光信號莺掠，并有光學設備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學信號轉化為測序堿基读宙。
二代測序流程（引自生信星球）
三代測序原理
第三代測序技術與前兩代相比彻秆，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增结闸。
原理： DNA聚合酶和模板結合唇兑，用4色熒光標記A,C,G,T這4種堿基（即是dNTP）。在堿基的配對階段桦锄，不同的堿基加入扎附，會發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型结耀。
三代測序
三代測序還可以檢測堿基的表觀修飾情況
甲基化（引自：生信小站）
補充知識：
高通量什么意思留夜？
打個比方匙铡，一代測序一次測序只能夠對1個基因進行測序，而高通量測序能夠一次檢測幾十甚至幾百個基因碍粥，這就是高通量鳖眼，同時產(chǎn)生的數(shù)據(jù)也很巨大，一代測序一次測幾百bp嚼摩，高通量測序一次測幾個Gbp
有一點疑惑钦讳，三代測序技術,實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序,為何物錯誤率比二代要高？
繼續(xù)查查
