單細(xì)胞測(cè)序基礎(chǔ)知識(shí)

一可霎、單細(xì)胞測(cè)序

學(xué)習(xí)scRNA-seq先了解一下Bulk RNA-seq

Bulk RNA-seq：測(cè)量一個(gè)大的細(xì)胞群體中每一個(gè)基因的平均表達(dá)水平分蓖，對(duì)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)（例如比較 不同物種的相同組織） 是有幫助的韧衣，但對(duì)于研究異質(zhì)性系統(tǒng)（例如其弊，復(fù)雜的組織如腦）還是不夠的巫橄，對(duì)于基因表達(dá)的本質(zhì)研究不夠深入慕爬。

scRNA-seq：
2009年由Tang首創(chuàng)窑眯，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及測(cè)序成本的的下降，2014年才逐漸流行開(kāi)來(lái)医窿。它測(cè)定的是細(xì)胞種群中每個(gè)基因的表達(dá)量分布磅甩，對(duì)于研究特定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化是重要的。
通量：測(cè)定的細(xì)胞量也由最初的10個(gè)左右姥卢，達(dá)到了現(xiàn)在的百萬(wàn)并且還在不斷遞增卷要，向著高通量的方向發(fā)展渣聚。
測(cè)序流程：現(xiàn)在主流的主要10X Genomics Chromium（較多細(xì)胞），SAMRT-seq2（較多基因）和Fluidigm C1等僧叉。當(dāng)然還有其他的如：CELL-seq奕枝、Drop-seq、mas-seq和Wafergen ICELL8等瓶堕。

測(cè)序方法

二隘道、單細(xì)胞測(cè)序流程

單細(xì)胞測(cè)序流程

三、方法主要分為兩大部分：定量與分離捞烟。

• 定量包括兩種類(lèi)型：全長(zhǎng)以及基于標(biāo)簽(tag)薄声。前者對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都試圖獲得一致的read覆蓋度，后者只捕獲5‘或者3’端的RNA题画。定量方法的選擇也影響了后續(xù)分析的方法選擇默辨。理論上，全長(zhǎng)的方法應(yīng)該得到轉(zhuǎn)錄本的平均覆蓋度苍息，但是實(shí)際上缩幸，覆蓋度經(jīng)常是有偏差的【核迹基于標(biāo)簽的方法能夠利用特異性分子標(biāo)記(Unique Molecular Identifiers, UMIs)提高定量準(zhǔn)確度表谊，但是呢，這種限制了轉(zhuǎn)錄組一端的方法有降低了轉(zhuǎn)錄本的可拼接性盖喷，讓以后的isoform識(shí)別變得困難爆办。

單細(xì)胞分離（Isolation of Single Cells）

單細(xì)胞分離方法：包括有限稀釋法（Limiting dilution technique）、顯微操作法（micromanipulation）课梳、流式細(xì)胞分選(FACS)距辆、激光捕獲顯微分離(LCM)、微孔（microwell）暮刃、微流控（microfluidics）和微滴（droplet）跨算。

有限稀釋技術(shù)（Limiting dilution technique）是利用移液管稀釋分離細(xì)胞，這種方法的主要缺點(diǎn)是效率低下椭懊，成功率20%左右诸蚕。
顯微操作法（micromanipulation）是一種經(jīng)典的方法，用于從少量細(xì)胞樣本中提取細(xì)胞氧猬，如早期胚胎或未培養(yǎng)的微生物背犯，缺點(diǎn)是耗時(shí)和低通量的。
流式細(xì)胞分選(FACS)廣泛用于分離單個(gè)細(xì)胞狂窑，在懸浮狀態(tài)下需要較大的起始體積(>10,000個(gè)細(xì)胞)媳板。
激光捕獲顯微分離(LCM)是利用計(jì)算機(jī)輔助的激光系統(tǒng)將單個(gè)細(xì)胞從固體組織中分離出來(lái)。
微孔microwell 優(yōu)勢(shì)是可以與熒光觸發(fā)細(xì)胞分離技術(shù)(FACS)結(jié)合泉哈，實(shí)現(xiàn)基于表面標(biāo)記的細(xì)胞選擇蛉幸。對(duì)于想要分離特定細(xì)胞群的研究很有效破讨；另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照奕纫，幫助確定孔中是否存在損傷的或者重復(fù)的細(xì)胞提陶。缺點(diǎn)是通量低，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行操作需要很大的工作量匹层。
微流控（microfluidics）相對(duì)微孔隙笆，它的通量更高。缺點(diǎn)是只有10%的細(xì)胞能被捕獲到升筏，加入處理的細(xì)胞類(lèi)型比較稀少撑柔，那么能被芯片捕獲的就更少了，通量不高您访，成本高铅忿。

微液控制技術(shù) 例如Fluidigm's C1

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微滴技術(shù) 是將單個(gè)細(xì)胞包裹在μl級(jí)別的液滴中，液滴被搭載到建庫(kù)所用的酶上灵汪，每個(gè)微滴包含一個(gè)獨(dú)特的條碼(barcode)檀训，由那個(gè)被包裝好的細(xì)胞產(chǎn)生的所有reads都被貼上了該條碼，也是為了之后對(duì)于不同細(xì)胞reads的分辨享言。一般微滴技術(shù)的通量最大峻凫，查資料得知一秒能包裝7萬(wàn)個(gè)以上的液滴，并且建庫(kù)費(fèi)用合適--0.05美元/細(xì)胞览露。但是高額測(cè)序費(fèi)用又成了他的短板荧琼，鑒定出的一般只有一千多個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本，覆蓋度還是比較低的

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這些單細(xì)胞分離方案具有各自的優(yōu)點(diǎn)差牛，可以根據(jù)研究目的來(lái)選擇合適的分離方法铭腕。

四、分析流程

黃色部分對(duì)于高通量數(shù)據(jù)的處理都是差不多的流程多糠；
橙色的部分需要整合多個(gè)轉(zhuǎn)錄組分析流程以及顯著性分析，來(lái)解決單細(xì)胞測(cè)序的技術(shù)誤差浩考；
藍(lán)色是下游表達(dá)量夹孔、通路、互作網(wǎng)絡(luò)等分析析孽，需要使用針對(duì)單細(xì)胞研發(fā)的方法搭伤。

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五、應(yīng)用

單細(xì)胞技術(shù)揭示細(xì)胞的異質(zhì)性袜瞬、細(xì)胞分化怜俐、發(fā)育過(guò)程中不同的生理狀態(tài)下的變化、疾病發(fā)生病變等生物學(xué)過(guò)程邓尤。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要應(yīng)用方向

1.大規(guī)模細(xì)胞圖譜構(gòu)建

特定組織裂解后通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜拍鲤，并基于每個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型聚類(lèi)贴谎，分析研究復(fù)雜器官中不同細(xì)胞亞型的功能，了解細(xì)胞間的差異以及各種細(xì)胞群體間的協(xié)作關(guān)系季稳。

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2.細(xì)胞亞群細(xì)化&稀有細(xì)胞類(lèi)型鑒定

在單細(xì)胞類(lèi)型聚類(lèi)基礎(chǔ)上擅这，依照已知細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)志基因表達(dá)情況和新基因表達(dá)情況，進(jìn)一步細(xì)分細(xì)胞類(lèi)型并發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞群景鼠，分析各個(gè)小亞群細(xì)胞差異仲翎，小亞群細(xì)胞和稀有細(xì)胞類(lèi)型在生物學(xué)過(guò)程參與的功能。

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3.腫瘤方向研究

• 腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性
• 腫瘤微環(huán)境
• 腫瘤耐藥性
• 腫瘤干細(xì)胞分化

4.干細(xì)胞發(fā)育及分化研究

通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序全面解析干細(xì)胞異質(zhì)性铛漓，鑒定干細(xì)胞分化不同階段的不同類(lèi)型分化過(guò)程細(xì)胞溯香，鑒定不同亞型干細(xì)胞Marker基因，繪制干細(xì)胞發(fā)育和分化軌跡浓恶，解析干細(xì)胞發(fā)育和分化的分子機(jī)理玫坛。

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5.免疫方向研究

• 構(gòu)建免疫圖譜

構(gòu)建血液或腫瘤微環(huán)境、特定組織器官或疾病狀態(tài)下免疫細(xì)胞構(gòu)成问顷，分析免疫細(xì)胞異質(zhì)性昂秃，解析機(jī)體復(fù)雜的免疫機(jī)制；發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞Marker基因杜窄，鑒定稀有免疫細(xì)胞類(lèi)型肠骆。

• 免疫細(xì)胞分化

鑒定不同疾病狀態(tài)、誘導(dǎo)條件下免疫細(xì)胞基因表達(dá)變化塞耕，鑒定不同分化方向免疫細(xì)胞Marker基因蚀腿，繪制免疫細(xì)胞細(xì)胞發(fā)育和分化軌跡

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6.神經(jīng)科學(xué)研究

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研究神經(jīng)元細(xì)胞分群情況以及不同神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型的異質(zhì)性，了解神經(jīng)干細(xì)胞-神經(jīng)元細(xì)胞分化過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制扫外。

7.發(fā)育生物學(xué)

• 腦發(fā)育研究

  
  
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可以獲得復(fù)雜的腦細(xì)胞基因表達(dá)圖譜莉钙，構(gòu)建腦細(xì)胞群體，解析腦細(xì)胞的異質(zhì)性以及不同亞群細(xì)胞的特定功能筛谚。

• 胚胎細(xì)胞發(fā)育研究

  
  
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8.生物標(biāo)志物/疾病分型

發(fā)現(xiàn)并鑒定異常增殖的細(xì)胞類(lèi)型磁玉，結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)特征，輔助疾病分型

參考
Analysis of single cell RNA-seq data https://scrnaseq-course.cog.sanger.ac.uk/website/index.html
單細(xì)胞測(cè)序的知識(shí) - 簡(jiǎn)書(shū) http://www.reibang.com/p/9fc521bf82ba
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的應(yīng)用方向_類(lèi)型 http://www.sohu.com/a/295025334_769248