[測(cè)序原理] CAGE-seq厢钧，加帽端mRNA測(cè)序霞扬，鑒定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS） - 知乎 (zhihu.com)
絕大多數(shù)基因有兩個(gè)甚至兩個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)斧拍，不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致基因受到不同的上游非翻譯區(qū)的調(diào)控作用（5'UTR）窍侧。
為何要測(cè)量5端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
不同的5'UTR序列中可能包含截然不同的作用元件，不同的起始位點(diǎn)導(dǎo)致了基因的表達(dá)所響應(yīng)的信號(hào)也完全不同伟件。同一個(gè)基因有可能受不同的啟動(dòng)子調(diào)控而導(dǎo)致表達(dá)的差異硼啤，可能會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生斧账。
CAGE-seq
CAGE-seq (Cap Analysis of Gene Expression AND deep Sequencing) 可以對(duì)mRNA中所有的TSS進(jìn)行鑒定嗓袱，這是通過加帽位點(diǎn)鑒定實(shí)現(xiàn)的
什么是加帽闪萄？
在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄中荆几，mRNA需要經(jīng)歷多種加工和修飾，包括剪接，5'端的加帽和3'端的加尾鸭栖，以及堿基上的化學(xué)修飾等松却，才能變?yōu)槌墒斓膍RNA砚哆，進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯。
其中刁标，加帽反應(yīng)能夠幫助細(xì)胞核的選擇性孔道穿過匈织，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，還可以防止mRNA5'端的穩(wěn)定性并增強(qiáng)翻譯缀匕。
首先RNA三磷酸酶從前體mRNA的5'端移去一個(gè)磷酸纳决，然后鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶在切除的末端加上一個(gè)鳥苷酸以形成5'-5'鍵；最后乡小，甲基轉(zhuǎn)移酶會(huì)對(duì)這個(gè)鳥苷酸進(jìn)行甲基化修飾阔加。
mRNA的帽子結(jié)構(gòu)一定存在它的5'端，只要有辦法鑒定這頂帽子满钟，就能找到它的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)胜榔。
建庫流程
CAGE - A highly sensitive and precise means of gene expression analysis. (cage-seq.com)
- 在得到mRNA樣品后，將mRNA序列碎片化為較短的小片段湃番。
- 對(duì)所有片段去磷酸化夭织，沒有“帽子”保護(hù)的末端的磷酸集團(tuán)將被磷酸酶移除，形成磷酸根離子和羥基吠撮。
- 使用脫帽酶將所有的“帽子”去除尊惰，只留下不受保護(hù)的5'端序列，但是因?yàn)闆]有被上一步使用的磷酸酶去磷酸化纬向，沒有羥基暴露出來择浊。
- 鏈接接頭，測(cè)序需要兩種接頭逾条，其中一種接頭被設(shè)計(jì)為鏈接有羥基暴露的磷酸琢岩，另一種則連接正常序列，因此只有原來受“帽子”保護(hù)的5'端序列才能同時(shí)結(jié)合兩種接頭师脂，通過測(cè)序得到序列信息担孔。
其他5端測(cè)序的方法
Comprehensive comparative analysis of 5’ end RNA sequencing methods - PMC (nih.gov)
