hello屡江，大家好，今天已經(jīng)是五一假期的第二天赛不，本人呢盼理，哪也去不了，只好在家歇著俄删，所以呢宏怔，給自己找點(diǎn)事做，本人93年畴椰，單身臊诊，現(xiàn)居天津武清，女孩子有沒有想談戀愛了斜脂，可以聯(lián)系我抓艳，聯(lián)系方式是。帚戳。玷或。。片任。偏友。《怨咳咳位他，錯(cuò)了，再來产场，今天我們就來聊一聊10X單細(xì)胞和10X空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞過濾的那些事鹅髓，我們來回顧一下：
過濾1、線粒體過濾
在我們的分析結(jié)果里京景，線粒體過濾應(yīng)該是繞不開的一個(gè)話題窿冯，我們?cè)诜治龅臅r(shí)候，通常會(huì)拿到如下的質(zhì)控圖（比較極端的一張作為示例）:
NPC1_nGene_nUMI_mito_HB.png
我們這里先來討論線粒體确徙，上面的圖其實(shí)相對(duì)比較極端醒串，但還不是最極端的执桌，首先我們要明白一下線粒體含量高代表了什么，我聽過很多單細(xì)胞專家的講解厦凤，其中有一個(gè)共識(shí)鼻吮，那就是線粒體過高育苟，代表了細(xì)胞的狀態(tài)變差较鼓，用大白話講，細(xì)胞狀態(tài)差违柏，膜完整性遭到破壞博烂，普通的mRNA處于游離狀態(tài)，會(huì)游離出來漱竖，而線粒體基因處于線粒體細(xì)胞器之內(nèi)禽篱，不容易游離出來，從而導(dǎo)致了線粒體基因的占比較高馍惹。這里呢躺率，我們首先要了解一些基礎(chǔ)知識(shí)：
- 線粒體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的場(chǎng)所 ：線粒體，對(duì)比于核轉(zhuǎn)錄組万矾，翻譯在細(xì)胞質(zhì)悼吱。
- 線粒體參與的生物學(xué)功能，能量供給,自由基生成和細(xì)胞凋亡良狈，其中后兩種功能都跟細(xì)胞狀態(tài)差有關(guān)后添。
所以無論從哪個(gè)角度看，線粒體高都不是一個(gè)正常的現(xiàn)象薪丁，那么就會(huì)有第一個(gè)問題：
（1）問題1遇西、線粒體占比多高算細(xì)胞狀態(tài)差？严嗜？粱檀？
我們細(xì)胞本身就需要能量，所以必然含有一定的線粒體基因漫玄，那么如何挑選細(xì)胞狀態(tài)差的呢梧税？？称近？在單細(xì)胞剛興起的時(shí)候第队，對(duì)于線粒體比例的認(rèn)識(shí)不足，一律按照線粒體的閾值為5%來進(jìn)行過濾刨秆，時(shí)至今日凳谦，很多深刻的問題來到了我們的身邊，一刀切肯定是不對(duì)的衡未，給大家分享一些常識(shí)：
- 不同類型的細(xì)胞線粒體含量實(shí)不一樣的尸执，其中肌肉細(xì)胞線粒體含量最高可達(dá)50%家凯，腫瘤區(qū)域的正常細(xì)胞線粒體含量有時(shí)也在30%以上
- 目前統(tǒng)計(jì)文章的閾值，在5%~30%之間不等如失，那么绊诲，我們應(yīng)該選多少？褪贵？掂之？
- 目前文獻(xiàn)中使用頻率最高的閾值是10%
我們以上圖為例，線粒體的閾值應(yīng)該是多少脆丁？世舰？10%合適么？槽卫？跟压？很顯然，不合適歼培，直觀的判斷閾值應(yīng)該在15%~20%之間震蒋，那么，到底應(yīng)該選擇多少呢躲庄？查剖？？我們畫一個(gè)直方圖看看：
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很符合預(yù)期读跷，在10%~20%之間有明顯的斷崖下降梗搅，那么這個(gè)地方，個(gè)人建議閾值設(shè)置為10%或者15%效览，最好的閾值應(yīng)該是15%无切。這里我們總結(jié)一下線粒體閾值判斷的原則就是，對(duì)線粒體含量進(jìn)行排序之后的異常區(qū)域進(jìn)行去除丐枉，具體情況具體分析哆键，不能搞一刀切。
過濾2瘦锹，紅細(xì)胞過濾
我們?cè)賮硪粡垐D作為分析示例
NPC2_nGene_nUMI_mito_HB.png
首先我們要討論一個(gè)問題籍嘹，紅細(xì)胞要不要過濾？弯院？如果我的研究重點(diǎn)就是紅細(xì)胞辱士，當(dāng)然不能過濾，如果不是呢听绳？颂碘？？這里就需要知道椅挣，紅細(xì)胞一旦過濾了头岔，會(huì)造成什么影響呢塔拳？？峡竣？
影響有以下幾個(gè)地方
1靠抑、高變基因的變化，不過濾高變基因含有紅細(xì)胞基因适掰，過濾掉就沒有這類基因了颂碧。
2、PCA成分的變化攻谁，PCA講過很多次了稚伍，軸的旋轉(zhuǎn)肯定收到基因變化的影響弯予，去除了一些高變基因戚宦，填補(bǔ)了一些次高變基因，會(huì)增加噪音锈嫩，影響降維受楼、聚類和分群。
3呼寸、閾值的選擇艳汽，目前文獻(xiàn)中明確去除紅細(xì)胞的很少，所以对雪， 需要相當(dāng)慎重河狐。
那如果是紅細(xì)胞污染呢？瑟捣？很多時(shí)候馋艺，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)制備之前需要確實(shí)是否進(jìn)行過裂紅處理，來減少紅細(xì)胞污染的影響迈套，所以呢捐祠，要根據(jù)自身的情況具體分析。
個(gè)人建議桑李，正常情況下踱蛀， 不需要過濾紅細(xì)胞。
3贵白、多細(xì)胞（雙細(xì)胞）的去除
不知道大家做分析有沒有去除過雙細(xì)胞率拒，一般來講，一般不會(huì)捕獲到雙細(xì)胞禁荒，但是隨著通量的增大猬膨，很有可能就要出現(xiàn)捕獲雙細(xì)胞的概率了，10X官網(wǎng)介紹了關(guān)于雙細(xì)胞捕獲的一些知識(shí)圈浇，其中捕獲一萬的細(xì)胞量寥掐，大約0.7%多是雙細(xì)胞靴寂，這里我們不展開了，關(guān)于多細(xì)胞去除我分享了很多了召耘，大家可以參考文章DoubletFinder百炬，python分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)，多細(xì)胞去除的模塊污它，多細(xì)胞去除之三剖踊，R包DoubletDecon,很多時(shí)候，我們可以直觀判斷衫贬，以下圖為例：
NPC2_nGene_nUMI_mito_HB.png
直觀判斷的話德澈，基因數(shù)高于6000的明顯是異常點(diǎn)，需要暫定為雙細(xì)胞固惯，很多文獻(xiàn)都是這樣的閾值來篩選雙細(xì)胞的梆造，但是我們需要注意，雙細(xì)胞的去除還是要借助專業(yè)的軟件葬毫，個(gè)人推薦的軟件是Scrublet镇辉，效果最好。
4贴捡、低基因數(shù)量的細(xì)胞去除
這個(gè)在很多時(shí)候我們一般認(rèn)為一個(gè)細(xì)胞維持生命至少需要多少個(gè)基因忽肛，不知道大家把這個(gè)閾值設(shè)成了多少，參照官網(wǎng)的實(shí)例代碼是200烂斋，個(gè)人人為這個(gè)值有點(diǎn)低屹逛，我們還是以下圖為例：
NPC3_nGene_nUMI_mito_HB.png
這樣的圖我們根本無法判斷，畫一個(gè)直方圖來看看
圖片.png
數(shù)值太大的關(guān)系汛骂，無從判斷罕模，我們截取一下：
圖片.png
這個(gè)地方看，如果最低基因設(shè)置成200香缺，那基本沒有過濾手销，但是大家看圖的結(jié)果，在500~1000處明顯有一個(gè)低谷图张，明顯的分界線锋拖，所以這里，設(shè)置成500也很合適祸轮，這個(gè)時(shí)候就要重點(diǎn)研究一下這個(gè)部分的一般特征兽埃，這些表達(dá)很低的細(xì)胞基因都有什么，功能是什么适袜，希望引起大家的注意柄错。那么，如果部分細(xì)胞基因數(shù)低會(huì)有什么影響呢？假設(shè)A細(xì)胞表達(dá)了500個(gè)基因售貌，B細(xì)胞表達(dá)的2000個(gè)基因给猾，在進(jìn)行均一化的時(shí)候，A細(xì)胞的基因數(shù)會(huì)擴(kuò)大20倍颂跨，某些基因會(huì)明顯的放大敢伸，而B細(xì)胞擴(kuò)大了10倍，很多假陽性的生物學(xué)差異由此誕生恒削，所以大家一定要慎重池颈。
5、多樣本整合的過濾問題
首先問大家一個(gè)問題钓丰，如果單樣本過濾分析之后躯砰，多樣本整合大家還過濾么？携丁？琢歇？如果答案是否，那么恭喜你则北，你已經(jīng)掉坑里了矿微，因?yàn)閱螛颖鹃撝档牟唤y(tǒng)一性痕慢，把你的數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行了一定的歪曲尚揣，很多結(jié)果，是假陽性掖举。
如果答案是否快骗，那么你有一定的幾率不會(huì)入坑，但不保證一定不入坑塔次，舉一個(gè)簡(jiǎn)單的例子方篮，正常樣本和腫瘤樣本的線粒體過濾的問題，如果用統(tǒng)一的閾值励负，那么恭喜你藕溅，你已經(jīng)進(jìn)坑了，上面說過了继榆，腫瘤組織的正常細(xì)胞線粒體基因的比例會(huì)變高巾表，如果用統(tǒng)一的閾值，恭喜你入坑了略吨，可能分析了很多還不知道結(jié)果為什么這樣集币，那么，到底翠忠，我們應(yīng)該如何做呢鞠苟？
結(jié)合文獻(xiàn)的思路，merge之后統(tǒng)一進(jìn)行過濾，很多文獻(xiàn)是這樣的做法当娱，但不代表都是這樣吃既，所以說這種方法更穩(wěn)妥一些，同時(shí)閾值會(huì)適當(dāng)調(diào)整跨细，以滿足樣本之間的異質(zhì)性态秧。其實(shí)真正的細(xì)胞過濾，也會(huì)有一些很深的算法支撐扼鞋！
所以說申鱼，如果進(jìn)行多樣本分析，不如直接做整合分析吧云头，單樣本的分析可以暫時(shí)放一放了捐友。
最后提一下關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組過濾的問題，個(gè)人建議溃槐，不要過濾匣砖，保留最原始的空間位置信息，即使線粒體比例高昏滴，也說明具有局部的生物學(xué)差異猴鲫。
生活很好，有你更好谣殊，再問一句拂共，有處對(duì)象的么？姻几？宜狐？ 祝大家51快樂
