hello，大家好俏讹，又是周一弯菊，新一周的開始纵势，今天我們要繼續(xù)分析我們的空間轉(zhuǎn)錄組的個性化分析，文章在Spatial Transcriptomics to define transcriptional patterns of zonation and structural components in the liver，其中的一些方法很值得我們借鑒钦铁，關(guān)于尋找空間轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)錄模式的方法我分享了很多了软舌，總結(jié)在這里，供大家借鑒和學(xué)習(xí)交流牛曹。

10X空間轉(zhuǎn)錄組 & 蛋白組聯(lián)合分析之空間分區(qū)模式

10X單細胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）分析之尋找目標bases基因集（factors）（PNMF）

10X單細胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析之DeepSEM

10X空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析之Pattern recognition and clustering

10X單細胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）層次聚類分析intra-tumor variability programs

10X單細胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)分析之NMF尋找轉(zhuǎn)錄programs

10X單細胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)分析之主成分分析（PCA）與因子分析（NMF）

好了佛点，開始我們今天的內(nèi)容分享

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其中最重要的分析有兩點

（1）區(qū)域A中富含的基因與區(qū)域B中富含的基因之間的 Pearson 相關(guān)性顯示出負趨勢，解釋為空間分離躏仇。 區(qū)域A與區(qū)域B中存在的所有其他標記基因呈正相關(guān)恋脚，解釋為空間相關(guān)（從基因的角度來解釋空間隔離）

（2）空間上的距離分析，這是也空間轉(zhuǎn)錄組研究的重點焰手。

ABSTRACT

近年來，通過單細胞轉(zhuǎn)錄譜重建異質(zhì)性極大地促進了我們對空間肝臟轉(zhuǎn)錄組的理解怀喉。然而书妻，小葉單位之間的全局轉(zhuǎn)錄差異在物理空間中仍然難以捉摸。在這里躬拢，運用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來對切片的肝組織進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析躲履。分析確認這種復(fù)雜組織的異質(zhì)性主要由小葉分區(qū)決定。通過引入新的計算方法（這是我們關(guān)注的重點）聊闯，實現(xiàn)了組織結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)錄梯度測量工猜，包括各種方向的幾個小葉。此外菱蔬，數(shù)據(jù)表明肝臟組織中存在先前轉(zhuǎn)錄未表征的結(jié)構(gòu)篷帅，有助于器官的整體空間異質(zhì)性。這項研究展示了綜合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)如何用于描繪肝臟中廣泛的空間基因表達模式拴泌，表明其對肝功能魏身、發(fā)育和再生研究的未來影響以及其在臨床前和臨床病理學(xué)中的潛力。

INTRODUCTION

哺乳動物肝臟是基本代謝穩(wěn)態(tài)和解毒的關(guān)鍵器官蚪腐。 它被認為在重要生物分子（如銨箭昵、脂肪酸、氨基酸和葡萄糖）的生成回季、交換和降解以及各種異生物質(zhì)化合物和毒素的轉(zhuǎn)化和根除方面發(fā)揮著核心作用家制。 根據(jù)物種的不同，肝臟被分成特定數(shù)量的葉泡一。 在小鼠中颤殴，肝臟可分為四個葉：內(nèi)側(cè)、左側(cè)（最大）瘾杭、右側(cè)（一分為二）和尾狀核诅病。 成熟的肝臟結(jié)構(gòu)以重復(fù)單位排列，稱為肝小葉。 簡而言之贤笆，小葉通常以六邊形表示蝇棉，在與相鄰小葉的每個連接處都有一個門靜脈 (PV)，富含營養(yǎng)的血液從腸道進入肝臟芥永。 最終篡殷，耗盡營養(yǎng)和氧氣的血液最終在中央靜脈 (CV) 中排出。 按區(qū)域劃分埋涧，大多數(shù)肝臟常駐細胞 (80%) 是實質(zhì)細胞板辽，即肝細胞。 其余 20% 的組織由肝臟非實質(zhì)細胞 (NPC) 組成棘催，包括： 肝內(nèi)皮細胞 (LEC)劲弦、肝臟駐留巨噬細胞 (庫普弗細胞) 和其他免疫細胞、肝星狀細胞 (HSC) 和其他基質(zhì)細胞醇坝、膽管上皮細胞 (膽管細胞) 和平滑肌細胞邑跪，共同構(gòu)成異質(zhì)功能性小葉肝環(huán)境。肝細胞根據(jù)它們與 CV 或 PV 的接近程度沿小葉軸執(zhí)行不同的功能呼猪。 在小鼠中画畅，這種代謝功能的空間劃分，稱為分區(qū)宋距，主要基于肝細胞沿小葉軸的差異表達譜轴踱，經(jīng)典地分為三個區(qū)域，區(qū)域 1 位于門靜脈谚赎，中間區(qū)域 2 和區(qū)域 3 位于 中央靜脈淫僻。 單細胞空間重建方法的最新發(fā)現(xiàn)表明，較小和較少的 NPC 也根據(jù)它們沿小葉軸的位置遵循不同的空間表達譜沸版。 這些重建方法 (1) 提供了肝小葉微環(huán)境內(nèi)代謝分工的復(fù)雜圖像嘁傀，(2) 基于沿小葉軸的 DGE 確定分區(qū)的定義因素，以及 (3) 代表了廣泛的基礎(chǔ)資源研究了肝分區(qū)的概念视粮。 然而细办，之前的所有研究都進行了激光捕獲顯微切割 (LCM) 或灌注技術(shù)，最終需要在測序前進行組織分離蕾殴，眾所周知笑撞，這會改變生理轉(zhuǎn)錄圖譜。

此外钓觉，以前的研究側(cè)重于確定僅在肝小葉微環(huán)境中分區(qū)的潛在因素茴肥。 對單個肝臟切片的研究表明，由于完整器官的 3 維組織和整體復(fù)雜性荡灾，重復(fù)肝小葉的理論組織具有挑戰(zhàn)性瓤狐。 跨組織的小葉以高度不規(guī)則的方式組織瞬铸，并且在組織內(nèi)的大小和軸向方向差異很大。 此外础锐，小葉與主要血液供應(yīng)源（即肝動脈和門靜脈）的接近程度各不相同嗓节。

研究肝組織的另一層復(fù)雜性是由它們組織成幾個葉而產(chǎn)生的。 這種劃分的原因尚不完全清楚皆警，但是拦宣，已經(jīng)提出了某些功能差異。 基因表達譜也可能因區(qū)域與其他葉的距離而異信姓。 因此鸵隧，在單個小葉和擴展組織環(huán)境中肝細胞組織之外的 DGE 模式研究很少，對于我們充分了解體內(nèi)平衡和疾病中的肝功能至關(guān)重要意推。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST) 能夠?qū)缃M織切片的空間基因表達進行高分辨率評估豆瘫，克服與組織解離相關(guān)的局限性。 肝臟分區(qū)可以對肝臟微環(huán)境（小葉）和肝臟宏觀環(huán)境（組織切片）中的結(jié)構(gòu)進行空間注釋左痢。 此外靡羡，在肝臟組織切片上執(zhí)行 ST 有能力揭示新的結(jié)構(gòu)，當(dāng)使用不允許在空間背景結(jié)構(gòu)中進行分析的方案時俊性，這些結(jié)構(gòu)可能會丟失，這些結(jié)構(gòu)可能對肝臟的整體結(jié)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用描扯。 （其實空間結(jié)構(gòu)對生物學(xué)的任何組織都很重要）定页。

在這里，對小鼠肝臟組織切片進行 ST绽诚，評估在轉(zhuǎn)錄水平上導(dǎo)致空間肝臟異質(zhì)性的空間因素典徊。通過設(shè)計和實施各種計算方法，本研究旨在解析參與肝臟分區(qū)的血管成分的空間關(guān)系（空間細胞的分布特征）恩够，并根據(jù)其轉(zhuǎn)錄譜和原始組織背景探索新的卒落、以前未表征的結(jié)構(gòu)。分析的結(jié)果支持分區(qū)是導(dǎo)致空間異質(zhì)性的最突出因素的概念蜂桶。計算追蹤與沿小葉軸分區(qū)相關(guān)的遺傳標記的表達水平使我們能夠研究物理空間中的分區(qū)梯度儡毕，并根據(jù)其表達譜推斷血管結(jié)構(gòu)的身份。預(yù)計扑媚，分析的結(jié)果腰湾，結(jié)合先前對構(gòu)成肝組織整體轉(zhuǎn)錄圖譜的不同細胞類型的發(fā)現(xiàn)，可以增強我們目前對肝組織組織的理解疆股。

RESULTS

Unsupervised clustering defines spatial distribution of expression across liver tissues（看來空間轉(zhuǎn)錄組的聚類還是很有必要的）

總共使用了 8 個來自尾狀核或右肝葉的野生型成年小鼠肝臟進行組織學(xué)染色费坊、文庫制備和測序。 在映射旬痹、過濾附井、注釋和歸一化之后讨越，我們獲得了由 19,017 個基因組成的表達數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)由 ST 陣列上 4,863 個單獨捕獲位置（spot）的 19,017 個基因組成永毅，并將數(shù)據(jù)用于下游計算分析把跨。 組織切片下的spot被考慮用于分析和可視化。

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• 注:Spatial transcriptomics was performed on a total of 8 murine liver tissue sections. The tissue sections were placed in one of six, 6.2 x 6.4 mm frames on the glass slide ST array. Each frame contains 1932 spots, with >200M uniquely barcoded, mRNA capture probes. The distance between centers of each neighboring spot is 150 μm. Initially, each tissue section was fixed, stained with hematoxylin and eosin (H&E), followed by imaging. Tissue sections were permeabilized, followed by mRNA capture, tissue removal and sequencing. Thereafter, the count data was subjected to cluster- and differential gene expression analysis (DGEA). The results of the clustering and DGEA were further analyzed and spatially annotated at the global tissue context and down to the lobular level. For new spatial annotations, pathway analysis was performed. Liver lobules are classically described by a central vein (CV, red) surrounded by 6 portal nodes (PV, blue) with neighboring bile-ducts (BD, green). For lobular spatial annotations, clusters have been computationally annotated by comparing expression levels in a set of genetic markers linked to metabolic zonation along the lobular axis.

每個spot都被少量的肝細胞混合物覆蓋（空間轉(zhuǎn)錄組目前還不能做到單細胞精度）卷雕。 從蘇木精染色的細胞核中节猿，我們估計每個spot包含 5-10 個肝細胞，每個spot最多包含 30 個細胞漫雕。 隨后滨嘱，我們通過非負矩陣分解（關(guān)于非負矩陣分解，大家可以參考文章10X單細胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)分析之NMF（非負矩陣分解））將數(shù)據(jù)嵌入到低維空間中浸间，并使用基于圖的方法以無監(jiān)督的方式對其進行聚類太雨，確定了 6 個cluster。

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• 注：Canonical correlation analysis (CCA魁蒜，這個方法主要是Seurat做整合的方法) was performed to integrate data of eight liver tissue sections, the data was subsequently normalized and subjected to graph-based clustering in which 6 clusters were identified (see methods). The integrated data was embedded in UMAP space (top) and depicted as an overlay of the spot cluster annotation across the tissue (bottom) (scale bar indicates 500 μm).

為了將cluster置于背景中并評估它們的空間組織囊扳，將spot投影在蘇木精和伊紅 (H&E) 染色組織的明場圖像上。

投影顯示屬于某些cluster的點之間存在明顯的空間隔離兜看。 乍一看锥咸，cluster 5 位于組織切片的專有區(qū)域，而屬于cluster 1 和cluster 2 的spot在視覺上似乎與肝組織中的血管結(jié)構(gòu)對齊（空間聚類和空間形態(tài)結(jié)構(gòu)很匹配）细移。為了進一步描述已識別的cluster搏予，我們在它們之間進行了 DGE 分析。 事實上弧轧，cluster 1 中的差異表達基因 (DEG) 支持先前研究中的門靜脈周圍基因表達雪侥，而先前與中心周基因表達相關(guān)的基因在cluster 2 中富集，表明cluster 1 和cluster 2 分別表示門靜脈和中央靜脈周圍的區(qū)域精绎。 cluster 3 顯示了與血紅蛋白相關(guān)的基因的富集速缨，而cluster 4 顯示了參與免疫相關(guān)過程的基因的富集表達。 cluster 5顯示間充質(zhì)基因的富集代乃。

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• 注：Heatmap depicting expression values of the five most variable genes for each cluster after subjecting the six clusters to DGEA, with the exception of cluster 3, which resulted in only four significantly differentially expressed genes.

cluster3旬牲、cluster4和cluster5的點主要被不同cluster的點所包圍，而cluster0襟己、1和2則形成了更具凝聚力的spot群引谜。 有趣的是，cluster 0擎浴、3 和 4 的spot似乎以descending order與cluster 0员咽、1 和 2 的點相鄰，這意味著大多數(shù)cluster的轉(zhuǎn)錄譜通常被門靜脈周圍而不是中心區(qū)域包圍贮预。 cluster 3 跨切片的分散空間分布很可能是因為組織在冷凍和切片之前沒有灌注贝室，這使我們能夠檢測整個肝臟的血細胞群契讲。 為了近似檢測每個點肝細胞預(yù)期轉(zhuǎn)錄組的方法的可重復(fù)性和敏感性，我們檢查了基因的表達滑频，據(jù)報道捡偏，這些基因是組織下各點肝臟中常見細胞類型的標記。

與組織的組織學(xué)評估一致峡迷，肝細胞標志物 Alb（表達值 > 1）在所有 4863 個點（100%）中的表達表明所有點都包含肝細胞银伟。 對于 LEC，1972 個點顯示 Cdh5 28,29 (~8%) 的表達绘搞。 淋巴肝內(nèi)皮細胞標志物 Lyve1 僅在 80 個點中的一小部分（0.02%）中表達彤避。 Kupffer 細胞標記 Clecf4 在 526 個點（~11%）中表達，而星狀細胞標記 Reln 在 568 個點（12%）中表達夯辖。 Spp1 是膽管細胞的標志物琉预，預(yù)計僅存在于膽管中，靠近門靜脈蒿褂，并以點狀表達 (~9%) 圆米。

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• 注：Visualization of spatial distribution of reported expression markers of Hepatocytes (Alb), liver endothelial cells (Cdh5), Kupffer cells (Clec4f), Cholangiocytes (Spp1), hepatic stellate cells (Reln) and lymphatic liver endothelial cells (Lyve1) by spots under the tissue. Pie-charts indicate the respective proportion of cell type markers present in spots under the tissue (scale bar indicates 500 μm).

這些結(jié)果表明，肝臟中體積更大啄栓、豐度更高的細胞在數(shù)據(jù)中是這樣表示的娄帖，而正如預(yù)期的那樣，更小和更稀有的細胞類型更分散在整個組織中（細胞類型的空間分布是非常重要的）昙楚。

雖然特征標記基因表達是推斷某些細胞類型存在的常用方法块茁，但我們希望包括更大的一組基因，這些基因構(gòu)成特定細胞類型的表達特征桂肌，并將其與我們的空間數(shù)據(jù)進行比較。 Stereoscope永淌，由安德森等人(Single-cell and spatial transcriptomics enables probabilistic inference of cell type topography)開發(fā)崎场， 通過使用概率負二項式模型，使來自單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)的細胞類型能夠在空間上映射到組織上遂蛀。 使用這種方法谭跨，我們能夠在肝組織切片上繪制由小鼠細胞圖譜 (MCA) 注釋的 20 種細胞類型。值得注意的是李滴，估計 MCA 中門靜脈周圍和中心周圍肝細胞的比例值很高螃宙。各點細胞類型比例之間的 Pearson 相關(guān)評分顯示正相關(guān)，可解釋為非實質(zhì)細胞（如 LEC所坯、上皮細胞和大多數(shù)免疫細胞以及基質(zhì)細胞）的空間共定位谆扎。

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• 注：Visualization of cell type co-localization by Pearson correlations (left). Positive correlation values indicate spatial co-localization of cell types while negative values represent spatial segregation. UMAP embedding of single-cell data of the Mouse Cell Atlas (MCA)41 grouped by annotated cell types (bottom right). Numeration behind the cell types represent annotation of MCA data (B cell-1 = Fcmr high, -2 = Jchain high, Dendritic cell-1 = Cst3 high, -2 = Siglech high, Epithelial cell-1 = Spp1 high, -2 = /, Eryhroblast-1 = Hbb-bs high, -2 = Hbb-bt high, Hepatocyte-1 = Fabp1 high, -2 = mt-Nd4 high, T cell-1 = Gzma high, -2: Trbcs2 high). Encircled clusters in the plot refer to pericentral or periportal hepatocytes of MCA data. Quantile scales of cell-proportions annotated as pericentral and periportal hepatocytes (see methods) are mapped on spatial transcriptomics spot data (top right).

對于與免疫相關(guān)的細胞類型，只有中性粒細胞與門靜脈周圍肝細胞和富含 Fabp1 的肝細胞呈輕微正相關(guān)芹助，同時與中央肝細胞呈負相關(guān)堂湖，表明空間隔離闲先。 有趣的是，門靜脈周圍和中心周圍肝細胞不僅相互之間呈負相關(guān)无蜂，而且與大多數(shù)其他細胞類型也呈負相關(guān)伺糠。 大部分spot被分配到cluster 1 和cluster 2，并且 100% 的spot包含肝細胞標記斥季，表明 - 在空間上 - 肝臟主要由分區(qū)肝細胞構(gòu)成训桶，而這些細胞僅代表 MCA 的一小部分數(shù)據(jù)。 這種差異說明了用空間基因表達數(shù)據(jù)補充單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以徹底描繪肝臟結(jié)構(gòu)和肝臟組織轉(zhuǎn)錄景觀的能力酣倾，同時證明了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集成的局限性舵揭。 重要的是，門靜脈周圍和中心周圍肝細胞與門靜脈和中央集群之間的相關(guān)性顯示出與空間數(shù)據(jù)觀察到的相似趨勢灶挟，提倡可靠整合來自 scRNA-seq 數(shù)據(jù)和我們的 ST 數(shù)據(jù)的細胞類型注釋琉朽。

Heterogeneous spatial gene expression linked to pericentral and periportal zonation

來自單細胞整合的門靜脈周圍或中心周圍分區(qū)的常見標記基因以及門靜脈周圍和中心周圍肝細胞的空間定位意味著cluster 1 和cluster 2 分別與門靜脈和中央靜脈共定位稚铣。 為了支持這一觀察箱叁，靜脈結(jié)構(gòu)根據(jù)膽管和門靜脈間充質(zhì) (PV) 的存在或缺乏 (CV) 被注釋為門靜脈、中央靜脈或未知類型的靜脈（不明確）惕医。 組織學(xué)注釋和相應(yīng)cluster的比較支持觀察耕漱，即cluster 1 表示門靜脈周圍區(qū)域，cluster 2 表示組織切片中的中心周圍區(qū)域抬伺。

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• 注：Visualization of spots representing gene expression profiles of cluster 1 (portal vein, blue) and cluster 2 (central vein, red) on H&E stained tissue (right), compared with visual histology annotations of central- (red circles) and portal- (blue circles) veins (left) (scale bar indicates 500 μm).

門靜脈周圍cluster 1 (PPC) 中富含的基因與中心周圍cluster 2 (PCC) 中富含的基因之間的 Pearson 相關(guān)性顯示出負趨勢螟够，解釋為空間分離。 PCC基因與PCC中存在的所有其他標記基因呈正相關(guān)峡钓，PPC標記基因與其他PPC標記呈正相關(guān)妓笙，解釋為空間相關(guān)

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• 注：Pearson correlations of genes expressed in cluster 1 and 2 ordered by their first principal component (see methods). Genes with high expression in the pericentral cluster (cluster 2) show negative correlation with genes highly expressed in the periportal cluster (cluster 1) and vice versa. Genes present within cluster 1 or cluster 2 exhibit positive correlation with genes in the same cluster.

在 PPC 或 PCC 標記基因與其余 4 個cluster（cluster 0、cluster 3能岩、cluster 4 和cluster 5）之間可以觀察到無相關(guān)性或相關(guān)性較低寞宫。 觀察到的基于門靜脈或中央靜脈同一性的肝組織切片空間基因表達的異質(zhì)性得到了標記基因空間自相關(guān)的進一步支持，其中高于 0.2 的值被認為表現(xiàn)出自相關(guān)拉鹃。 較高的值表明基因表達和組織定位的正相關(guān)性更強辈赋，而較低的值 (<0.2) 表明基因表達和空間的獨立性。在 UMAP 嵌入中具有代表性的 pericentral (Glul) 和 periportal (Sds) 標記表達的spot的可視化進一步證明了 Glul 或 Sds 在 pericentral 或 perportal cluster中的最高表達值膏燕。 此后钥屈，表達值降低，表現(xiàn)出代表相反靜脈類型的cluster中spot的最低值坝辫。 當(dāng)在其空間環(huán)境中的spot上顯示 Glul 和 Sds 的表達時篷就，這些基因在標注為中央或門靜脈的區(qū)域中表現(xiàn)出最高的表達。 此外阀溶，在高 Glul 表達的區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn) Sds 的表達腻脏，反之亦然鸦泳，表明存在于中央cluster1 和門靜脈cluster 2 中的基因表達在空間上是不同的，并且彼此呈負相關(guān)永品。

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• 注：Projection of selected markers for central venous expression (Glul, top) and periportal expression (Sds, bottom) in UMAP space and spots under the tissue (scale bar indicates 500μm).

Transcriptional profiling of pericentral and periportal marker genes across tissue spaceenable computational annotation of liver veins

為了進一步研究物理空間中的分區(qū)做鹰，我們首先在組織學(xué)注釋的靜脈上疊加顯示中心靜脈（Glul，Cyp2e1）和門靜脈（Sds鼎姐，Cyp2f2）的兩個代表性標志物表達的組織下的spot钾麸。

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Glul 負責(zé)谷氨酰胺合成酶的表達，谷氨酰胺合成酶是谷氨酰胺合成的主要酶炕桨，而絲氨酸脫水酶 (Sds) 是糖異生的關(guān)鍵因素饭尝。 Cyp2e1 和 Cypf2 都屬于參與異生物質(zhì)代謝的細胞色素 p450 家族。 Glul 的中心周表達僅限于非诚坠靠近帶注釋的中央靜脈的點钥平，而 Cyp2e1 更均勻地分布在各點上，在附近帶注釋的門靜脈周圍無法檢測到這兩種基因姊途。 對門靜脈周圍 Sds 和 Cyp2f2 的表達進行了類似的觀察萧落。 包括 PCC 和 PPC 的所有標記基因叠蝇，并創(chuàng)建組織下斑點中各個cluster的所有 DEG 表達的模塊分數(shù)，我們將沿小葉軸的共同表達梯度可視化。

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接下來杂曲，我們想評估基因表達是否受與不同靜脈類型的空間接近度的影響渡讼，正如基于 Halpern 等人的研究所預(yù)期的那樣(Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver)砸紊，描述了沿小葉軸總共 9 層的表達梯度备燃。 為此，我們生成了所謂的距離圖表達式顶考； 將標準化的基因表達描述為與相應(yīng)靜脈類型的距離的函數(shù)赁还。為了構(gòu)建這些圖，對于每個點和基因驹沿，我們將觀察到的表達值與從點中心到最近的靜脈邊界的距離配對秽浇。 最后，為了更好地捕捉距離和expression之間的關(guān)系甚负，我們使用 loess 方法平滑我們的觀察。 對一組選擇的五個門靜脈周圍和中心周圍標記基因的距離圖進行表達审残，這些基因在 PPC 和 PCC 中具有最高的陽性 logFC.在檢查圖后梭域，距離和表達之間的明顯依賴變得明顯。 門靜脈標志物隨著與門靜脈的距離增加而逐漸下降搅轿。 對于中央靜脈病涨，某些基因（例如 Glul、Slc1a2 和 Oat）的表達隨著距中央靜脈距離的增加而急劇下降璧坟，而其他基因（例如 Cyp2e1 和 Cyp2a5）則表現(xiàn)出更緩慢的下降既穆。

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• 注：Visualization of the average expression by distance to vein-type measured within 50 μm from the vein. The top row shows expression by distance of portal markers Sds, Cyp2f2, Hal, Hsd17b13 and Aldh1b1 to portal veins in blue and central veins in red, while the bottom row shows distances of central vein markers Glul, Oat, Slc1a2, Cyp2e1 and Cyp2a5 to portal veins in blue and central veins in red (top panel). Visualization of relative proximity of portal vein markers in the top row and central vein markers in the bottom row to both vein types. The gene expression as a function of the logged relative distances (see methods for details), negative values on the x-axis indicate points with closer proximity to central veins in red compared to portal veins in blue and vice versa for positive values, as indicated by the schematic (below graphs).

這些結(jié)果與 Halpern 等人(Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver)在空間重建層中觀察到的表達梯度一致赎懦。 此外，我們將 MCA 單細胞數(shù)據(jù)中帶注釋的門靜脈周圍和中心周圍肝細胞的映射比例值沿小葉軸對齊幻工，并觀察到與標記基因觀察到的與其相關(guān)靜脈類型的距離相同的反比關(guān)系 .

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雖然距離圖的表達揭示了一種靜脈類型對物理距離中基因表達的影響励两，但我們希望同時解釋兩種靜脈類型的最終接近度。 因此囊颅，我們開發(fā)了距離比圖的表達当悔，其中使用了兩種靜脈類型距離之間的對數(shù)比。 使用距離圖表達的物理距離的這些比例值踢代，我們可以解釋兩種靜脈類型的存在盲憎，研究它們對空間表達presence的影響。 我們觀察到沿小葉軸的門靜脈基因幾乎呈線性關(guān)系胳挎，表現(xiàn)出最接近中央靜脈的最低值和最接近門靜脈的最高標記基因表達饼疙。 同時，中央標記的表達在非衬脚溃靠近中央靜脈的地方表現(xiàn)出陡峭的負斜率窑眯，而向門靜脈附近的下降幅度較小。觀察到的不同中央和門靜脈標志物沿小葉軸表達的差異與早期概念“梯度”型基因沿小葉軸“動態(tài)”表達的基因和“室”型基因的“穩(wěn)定”基因表達一致 直接在中央或門靜脈邊界處澡罚。室類型基因的空間穩(wěn)定表達以Glu1和谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白Slc1a2為例伸但，對中央靜脈的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運很重要。 參與銨生產(chǎn)的 Sds 和組氨酸解氨酶 (Hal) 的表達對于門靜脈的穩(wěn)定基因表達而言是獨特的留搔。 Cyp2e1 (pericentral) 和 Cyp2f2 (periportal) 說明了梯度型基因的動態(tài)表達更胖。

鑒于 PPC 和 PCC 中 DEG 之間的強關(guān)聯(lián)，以及與組織學(xué)注釋的中央和門靜脈共定位的令人信服的證明隔显，我們旨在探索僅基于基因表達以計算方式注釋中央和門靜脈的潛力却妨。

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• 注：Visual histological annotations (left) of central (red) and portal (blue) veins, including ambiguous visual annotations (green), compared with computational prediction, using the 10 marker genes from 3b (right). The classification of vein types is based on a weighted (by distance) average expression of the genes expression profiles in the neighborhood of each vein. In addition, the spatial expression data of spots neighboring uncertain morphological vascular annotations (green) can be used to deduce periportal or pericentral vein-types in the cases where visual annotations are ambiguous.

由于多種原因，靜脈的計算注釋作為手動注釋的補充具有相關(guān)性括眠。首先彪标，當(dāng)只有質(zhì)量欠佳或沒有免疫組織學(xué)染色的組織學(xué)圖像可用時，有時證明視覺注釋很困難掷豺。其次捞烟，這是一個勞動密集型過程，需要徹底的組織學(xué)培訓(xùn)当船，但并不總是可用题画。因此，計算模型不僅提供了支持視覺靜脈注釋的可能性德频，而且還提供了基于其周圍基因表達譜預(yù)測未注釋靜脈的類型的可能性苍息。本研究中構(gòu)建的模型令人信服地對應(yīng)于視覺注釋的中央靜脈和門靜脈，其基于來自不同生物起源（尾狀核和右肝葉）的所有切片的各自鄰域的表達譜【核迹基于重疊的視覺和計算靜脈注釋的可信證明表谊，我們繼續(xù)對身份不確定的靜脈進行計算注釋。我們的結(jié)果顯示了估計的 72 條不明確的靜脈分配到中央靜脈或門靜脈盖喷，這是從每個靜脈附近的 5 個中央或門靜脈標記的子集的距離的表達推斷出來的

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• 注：Expression by distance of portal - (top panel) and central - (bottom panel) markers. Probabilities for each class (central and portal) can be extracted from the logistic regression model, here given as P(central) or P(portal) (scale bar indicates 500μm).

根據(jù)周圍spot的空間表達譜推斷靜脈類型證明了將空間基因表達數(shù)據(jù)用于各種基于注釋的應(yīng)用的潛力爆办。

Exploration of components contributing to spatial heterogeneity across liver tissues

在染色圖像上投影分配給cluster 5的點坐標顯示整個組織的一個或兩個不同區(qū)域中的專屬空間組織.

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• 注：Projection of spots including transcriptional patterns of cluster 5 in the UMAP (from Fig 1b), on a selected part of a histological section of the caudate lobe (left) and spot location in the entire tissue section (right).

因此，我們詢問該cluster如何根據(jù)其表達譜適應(yīng)空間肝臟組織传蹈。 此外押逼，我們想評估該cluster的空間組織是否可以指示該組織區(qū)域中潛在不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的功能，其特征在于類似于潛在組織分區(qū)的形態(tài)惦界。

DGEA 將 Gsn挑格、Col1a2、Col1a3 和 Vim 鑒定為cluster5的高度上調(diào)標記基因沾歪。第 5 類身份之外的spot漂彤，顯示未觀察到這些基因的表達或低表達

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• 注：Visualization of Vim, Col3a1, Col1a2 and Gsn expression in spots of the same tissue section as in 4a。

在四個基因中灾搏，Col1a2 和 Col3a1 表示目視檢查時的最高表達挫望。 事實上，cluster5標記基因的通路分析表明狂窑，屬于“膠原和纖維組織”基因本體的基因富集最強.

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除了 Col1a2 和 Col3a1 之外媳板，cluster 5 中還有四個標記基因?qū)儆谶@個生物過程（Dpt、Col1a1泉哈、Lum 和 Col14a1）蛉幸。 據(jù)報道，膠原原纖維是構(gòu)成包括嚙齒動物在內(nèi)的幾種動物的 Glisson 囊的不規(guī)則結(jié)締組織的主要成分丛晦，首次表明了cluster5的結(jié)構(gòu)功能奕纫。此外，有助于結(jié)構(gòu)形成和發(fā)育的過程烫沙，例如 作為“細胞外基質(zhì)組織”和“細胞外結(jié)構(gòu)組織”以及與先天免疫相關(guān)的途徑匹层，即“對細胞因子的反應(yīng)”、“通過 MHC II 類肽或多糖抗原的抗原加工和呈遞”顯示在cluster 5 內(nèi)富集.

參與“膠原蛋白和原纖維組織”的標志物的表達分數(shù)在cluster5點中的點以及它們在組織中的直接接近處最高锌蓄，而其余組織的分數(shù)較低升筏。 相比之下，參與細胞因子反應(yīng)的標記基因（H2-Eb1瘸爽、Timp2仰冠、Timp3、H2-Aa蝶糯、Cd74、H2Ab1辆沦、Spp1昼捍、Gsn识虚、Col3a1、Vim）的表達評分更均勻地分布在整個組織中.

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• 注：Module scores of genes (see methods) in cluster 5 belonging to the two biological processes with the highest enrichment scores: “collagen fibril organization” and “response to cytokine” are visualized on spots across the tissue.

這一結(jié)果支持了cluster5及其周圍組織區(qū)域的結(jié)構(gòu)形成和發(fā)育過程的更高重要性妒茬。

此外担锤，所有cluster的標記基因之間的 Pearson 相關(guān)性表明，大多數(shù)cluster 5 標記顯示cluster 1 或cluster 2 的基因之間沒有相關(guān)性乍钻，并且大多數(shù)cluster 5 標記顯示顯著的空間自相關(guān)肛循。 綜上所述，cluster 5 標記物的相關(guān)性分析和各自組織區(qū)域的組織學(xué)形態(tài)主張cluster 5 的空間組織银择，獨立于肝分區(qū)多糠。

DISCUSSION

在哺乳動物肝臟上應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)是探索其轉(zhuǎn)錄和功能異質(zhì)性的一個新的、引人注目的場所浩考，同時也補充了以前的數(shù)據(jù)夹孔。 最近的 scRNA-seq 研究包括通過重建進行空間整合，提供了單細胞轉(zhuǎn)錄組的高分辨率信息析孽，但由于組織解離搭伤，這些細胞在組織內(nèi)的空間組成丟失，這額外增加了不良轉(zhuǎn)錄變化的風(fēng)險袜瞬。 相比之下怜俐，ST 在其真實的組織環(huán)境中保留了基因表達的空間信息，從而絕對補充了單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法邓尤。 將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與同一組織的從頭和現(xiàn)有單細胞和其他組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合的新興可能性提供了對組織生物學(xué)的前所未有的洞察力拍鲤。

在這里，我們以兩種不同的方式將細胞類型信息合并到空間數(shù)據(jù)中裁赠。首先殿漠，我們在廣泛的表達水平范圍內(nèi)評估了特征標記基因的表達。預(yù)計稀少存在的基因的一個例子是淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體 (Lyve1)佩捞。與這些罕見的細胞類型相反绞幌，據(jù)報道，肝組織按面積由多達 80% 的肝細胞組成一忱。因此莲蜘，在組織下的所有點中都以高頻率檢測到 Alb 轉(zhuǎn)錄物。最近的一項研究表明帘营，庫普弗細胞主要定位于肝小葉的門靜脈周圍區(qū)域票渠，細菌感染時會募集中性粒細胞。然而芬迄，我們的數(shù)據(jù)并未表明庫普弗細胞標志物在我們數(shù)據(jù)的門靜脈周圍cluster中顯著富集问顷，中性粒細胞和門靜脈周圍肝細胞的共定位表明中性粒細胞的門靜脈周圍定位已經(jīng)處于未受干擾的條件下，支持提議的免疫分區(qū)的含義。肝臟不斷暴露于來自門靜脈周圍血液的有毒和微生物威脅杜窄，需要在免疫低反應(yīng)性和有效清除病原體之間取得有效平衡肠骆。因此，進行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)以研究感染和炎癥對提議的免疫分區(qū)的影響將是非常有意義的塞耕。

其次蚀腿，使用立體鏡對混合細胞表達譜進行解卷積顯示，中心周圍和門靜脈周圍肝細胞的比例值高于所有其他細胞類型扫外，這可能解釋了我們數(shù)據(jù)中中心周圍和門靜脈周圍肝細胞與大多數(shù)其他細胞類型之間的主要空間分離莉钙。在我們的和 MCA 數(shù)據(jù)中觀察到的肝細胞數(shù)量之間的差異可能是由于 scRNA-seq 以及空間數(shù)據(jù)生成面臨的不同技術(shù)限制造成的，強調(diào)了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集成的當(dāng)前限制筛谚。來自轉(zhuǎn)錄高度活躍或物理大細胞的轉(zhuǎn)錄物可能會掩蓋具有中低轉(zhuǎn)錄水平的細胞類型磁玉。因此，提高分辨率的技術(shù)和計算進步可能有利于組織內(nèi)稀有細胞類型的轉(zhuǎn)錄分析刻获。盡管如此蜀涨，與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的比較證實了在我們的 ST 數(shù)據(jù)中觀察到的一般趨勢，突出了將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)相結(jié)合的重要性我們用反相關(guān)空間分布和特征標記基因表達注釋了兩個clusterH&E 圖像中的門靜脈或中央靜脈作為門靜脈周圍 (PPC) 和中心周圍 (PCC) cluster蝎毡『窳總體而言，本研究中生成的空間數(shù)據(jù)支持以下假設(shè)：肝組織空間異質(zhì)性的主要來源是門靜脈和中央靜脈之間沿小葉軸的區(qū)域之間的轉(zhuǎn)錄差異沐兵。

此外别垮，“隔室”型分區(qū)中心標記 Glul 和 Slc1a2 以及門戶標記 Sds 和 Hal 的示例性表達說明，執(zhí)行相反任務(wù)（如谷氨酰胺和銨合成）的基因表達的區(qū)室化對于防止無效循環(huán)是必要的扎谎，并說明了 沿波爾圖-中軸的生化分區(qū)的相關(guān)性碳想，已進行徹底審查。 我們的數(shù)據(jù)引入了“隔室”和“動態(tài)”標記的距離閾值毁靶，并跟蹤來自外靜脈邊界和跨物理空間的表達梯度胧奔。

此外，我們同時調(diào)查了門靜脈和中央靜脈的標記基因表達之間的關(guān)系预吆。 標注為組織中心的靜脈描繪了表達和與門靜脈類型的距離之間令人信服的反比關(guān)系龙填。 組織中所有視覺注釋靜脈的標記基因表達不足以確認被六個門靜脈節(jié)點包圍的一個中央靜脈的肝葉的擬議示意圖組織。 然而拐叉，結(jié)果表明中央和門靜脈之間的分區(qū)標記的整體關(guān)系在整個組織的門-中軸之間是可比的岩遗，獨立于物理空間中小葉的示意性組織。

基于整個組織中中央靜脈和門靜脈的穩(wěn)健表達譜的令人信服的證據(jù)凤瘦，我們能夠生成一個計算模型宿礁，以根據(jù)相鄰點的表達譜，在視覺注釋不明確的情況下預(yù)測靜脈類型蔬芥。該計算模型證明了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在輔助形態(tài)學(xué)注釋方面的巨大潛力梆靖，通過轉(zhuǎn)錄分析為自然組織位置的形態(tài)結(jié)構(gòu)的計算注釋的確定性提供概率值控汉。我們預(yù)計這種方法將在未來的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中提供多種應(yīng)用，例如返吻。與病理或感染有關(guān)暇番。cluster 5 由少量具有不同空間定位的點組成。因此思喊，如果該cluster的轉(zhuǎn)錄譜是由一種或多種不同細胞類型的存在引起的，由于肝臟 scRNA-seq 實驗的技術(shù)限制次酌，這些細胞類型可能會丟失恨课。cluster5 spot顯示間充質(zhì)細胞標記的表達，并與“膠原原纖維組織”途徑相關(guān)岳服。我們建議cluster 5 可能代表 Glisson 囊的一部分剂公，由膠原纖維及其下方的間皮組成，代表包裹肝臟的結(jié)締組織和具有更厚的肝門周圍間充質(zhì)的區(qū)域吊宋。膠囊保持了松散構(gòu)造的肝臟的結(jié)構(gòu)完整性纲辽，并能夠分裂成葉 .

據(jù)報道，間充質(zhì)細胞標志物 Vim 可維持間充質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)璃搜，并作為肝細胞和 Gsn 中細胞增殖活性的指標拖吼，編碼肌動蛋白結(jié)合蛋白 GELSOLIN 在肝臟中具有抗凋亡作用。 抗凋亡作用和結(jié)締組織的富集这吻，可能來自 Glisson 囊吊档，在器官的脆弱位置或靠近肝葉連接位置可能是至關(guān)重要的。 涉及cluster 5 中結(jié)構(gòu)完整性的另外兩條途徑唾糯，即“細胞外基質(zhì)組織”和“細胞外結(jié)構(gòu)組織”怠硼，進一步支持該cluster中細胞的結(jié)構(gòu)功能。觀察到與細胞因子反應(yīng)相關(guān)的基因本體的富集移怯， 但不限于香璃，cluster 5；因此它們是貢獻而不是定義cluster的表達譜和結(jié)構(gòu)功能的組成部分舟误。

關(guān)于將肝臟分成多個葉的功能原因以及維持器官結(jié)構(gòu)完整性的知識仍然不完整葡秒。 考慮到本研究中使用的樣本量，我們可以提供初步跡象脐帝，而不是對該提議結(jié)構(gòu)功能的一般性聲明同云。 除了捕獲和支持先前觀察到的哺乳動物肝臟組織異質(zhì)性趨勢之外，我們的研究還可以作為進一步研究上述過程中涉及的結(jié)構(gòu)成分和候選基因的空間表達的寶貴資源堵腹。

總之炸站，本研究提出了一種通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和創(chuàng)新計算方法研究肝組織轉(zhuǎn)錄景觀的新方法。 我們設(shè)計并實施了允許物理距離測量和靜脈預(yù)測的計算工具疚顷。 此外旱易，我們提議在肝組織中存在轉(zhuǎn)錄上不同的結(jié)構(gòu)禁偎，這可能是由于形成這些結(jié)構(gòu)的細胞很少見，而以前尚未使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析報告過這些結(jié)構(gòu)阀坏。

隨著空間基因組學(xué)領(lǐng)域未來的預(yù)期進展如暖，分辨率的提高將促進對組織空間中稀有細胞類型的詳細研究。 這項研究對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)為肝臟研究提供的好處進行了令人信服的初步探索忌堂，并將其視為肝病學(xué)領(lǐng)域的寶貴數(shù)據(jù)資源盒至。 我們進一步預(yù)計 ST 將對未來涉及肝臟發(fā)育、免疫和一般病理學(xué)的研究非常有益士修。

Method（關(guān)注一下距離計算和相關(guān)性的方法）

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差異表達分析枷遂，注意這里的閾值選擇，以及空間分布的特點

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空間相關(guān)性

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距離分析

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Expression-based classifier

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生活很好棋嘲，有你更好