hello漂问，大家好赖瞒，又到了周五了，一周的收官之戰(zhàn)蚤假，今天分享的內(nèi)容有點(diǎn)多栏饮，涉及到很多單細(xì)胞和空間的分析方法，我們要精讀并且進(jìn)行深入的解析勤哗，我認(rèn)為方法都很經(jīng)典抡爹，而且運(yùn)用的也比較好，我們慢慢逐一解析芒划，文章在Lineage-specific regulatory changes in the pathological cardiac remodeling of hypertrophy cardiomyopathy unraveled by single-nucleus RNA-seq and spatial transcriptomics 冬竟，非常棒的文章，這一次我們要詳細(xì)分享民逼。

先來(lái)一張酷炫的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

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ABSTRACT

BACKGROUND

肥厚型心肌脖门埂（HCM）是最常見(jiàn)的心臟遺傳性疾病，具有心肌細(xì)胞肥大和心臟纖維化的組織病理學(xué)特征拼苍。 HCM 患者心肌中發(fā)生的病理重塑可能最終發(fā)展為心力衰竭和死亡笑诅。 徹底了解 HCM 病理性心臟重塑中細(xì)胞類(lèi)型特異性變化對(duì)于開(kāi)發(fā)成功的醫(yī)學(xué)療法以預(yù)防或減輕這種疾病的進(jìn)展至關(guān)重要。

METHODS

通過(guò)對(duì) 10 名 HCM 患者和 2 名健康供體的心臟組織進(jìn)行了單核 RNA-seq疮鲫，并對(duì) 3 名 HCM 患者的 4 個(gè)心臟組織切片進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析吆你。 進(jìn)行比較分析以探索 HCM 患者心臟組織中表達(dá)譜、亞群組成和細(xì)胞間通訊的譜系特異性變化俊犯。 基于包括偽時(shí)間排序（軌跡分析）妇多、差異表達(dá)分析和差異調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析在內(nèi)的獨(dú)立分析的結(jié)果，優(yōu)先考慮用于減輕 HCM 進(jìn)展為心力衰竭或減輕心臟纖維化的候選治療靶點(diǎn)燕侠。 使用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)者祖，我們檢查了關(guān)鍵候選基因立莉、通路和亞群的空間活動(dòng)模式。（單核轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析）七问。

RESULTS

來(lái)自 HCM 和健康條件的 55,122 個(gè)細(xì)胞核的無(wú)偏聚類(lèi)揭示了 9 個(gè)細(xì)胞譜系和 28 個(gè)cluster蜓耻。 觀察到 HCM 中血管相關(guān)譜系的顯著擴(kuò)張和心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的收縮械巡。 揭示了 HCM 中心肌細(xì)胞向衰竭狀態(tài)過(guò)渡期間的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)刹淌。 獲得了用于減輕 HCM 進(jìn)展為心力衰竭的候選靶基因，例如 FGF12坟比、IL31RA芦鳍、BDNF、S100A1葛账、CRYAB 和 PROS1柠衅。 還揭示了成纖維細(xì)胞活化背后的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)，并獲得了減輕 HCM 心臟纖維化的候選靶標(biāo)籍琳，例如 RUNX1菲宴、MEOX1、AEBP1趋急、LEF1 和 NRXN3 喝峦。

CONCLUSIONS

對(duì) HCM 中特定于譜系的regulatory changes進(jìn)行了全面分析。 文章的分析確定了大量候選治療靶基因和途徑呜达，以預(yù)防或減輕 HCM 的病理重塑谣蠢。 用到的數(shù)據(jù)集構(gòu)成了一種寶貴的資源，可以在單核和空間分辨率下檢查 HCM 的譜系特異性表達(dá)變化查近。

INTRODUCTION

肥厚型心肌病 (HCM) 是最常見(jiàn)的心臟遺傳疾病眉踱，估計(jì)患病率最低為 200 分之一。 HCM 也是年輕人心臟猝死 (SCD) 的主要原因霜威，占年輕運(yùn)動(dòng)員 SCD 的 36%谈喳。 HCM 的特征是在沒(méi)有其他心臟或全身疾病的情況下左心室壁厚度增加。 HCM 的主要組織病理學(xué)特征包括心肌細(xì)胞肥大和紊亂以及心臟纖維化戈泼。病理性心臟重構(gòu)發(fā)生在 HCM 患者的心肌中婿禽，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞功能障礙、成纖維細(xì)胞活化（纖維化）增加大猛、慢性炎癥和細(xì)胞死亡扭倾。如果不及時(shí)治療，病理重塑可能最終導(dǎo)致不良事件挽绩，包括心力衰竭膛壹、心律失常和死亡。近年來(lái)琼牧，已經(jīng)為設(shè)計(jì) HCM 治療劑做出了重大努力恢筝，例如，用于抑制心肌肌球蛋白 ATP 酶的 MYK-461巨坊。徹底了解 HCM 病理性心臟重塑中的細(xì)胞和分子變化對(duì)于開(kāi)發(fā)成功的醫(yī)學(xué)療法以預(yù)防或減輕這種疾病的進(jìn)展至關(guān)重要撬槽。

HCM 心臟組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變先前已通過(guò)大量 RNA-seq 在組織水平上進(jìn)行了檢查。 然而趾撵，無(wú)法從大量數(shù)據(jù)中獲得細(xì)胞類(lèi)型特異性變化侄柔。單細(xì)胞或單核 RNA-seq (snRNA-seq) 可以克服這一限制，并允許以前所未有的分辨率對(duì)細(xì)胞變化進(jìn)行無(wú)偏見(jiàn)的剖析占调。鑒于成人心肌細(xì)胞的體積較大暂题，snRNA-seq 已成功應(yīng)用于解剖健康和患病條件下成人心臟的異質(zhì)性，例如心肌梗塞究珊。 然而薪者，仍然缺乏探索轉(zhuǎn)錄組變化的研究HCM 的單核分辨率。最近出現(xiàn)的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過(guò)提供在單細(xì)胞/核數(shù)據(jù)中丟失的表達(dá)空間信息剿涮，極大地?cái)U(kuò)展了我們理解疾病細(xì)胞機(jī)制的范圍和能力言津。 snRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的綜合分析將深刻提高我們對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

在這項(xiàng)研究中取试，研究對(duì) HCM 患者和健康供體的心臟組織進(jìn)行了 snRNA-seq悬槽。還對(duì) HCM 患者的心臟組織切片進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。進(jìn)行比較分析以探索 HCM 患者心臟組織中表達(dá)譜瞬浓、亞群組成和細(xì)胞間通訊的譜系特異性變化初婆。分析確定了 HCM 心肌細(xì)胞向衰竭狀態(tài)過(guò)渡期間的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)，并優(yōu)先考慮了用于減輕 HCM 心力衰竭進(jìn)展的候選治療靶基因猿棉，例如 FGF12磅叛、IL31RA、BDNF铺根、S100A1宪躯、CRYAB 和 PROS1。還重建了成纖維細(xì)胞活化的軌跡位迂，并優(yōu)先考慮了減輕 HCM 中心臟纖維化的候選目標(biāo)访雪，例如 RUNX1、MEOX1掂林、AEBP1臣缀、LEF1 和 NRXN3。分析提供了大量候選靶基因和通路泻帮，用于設(shè)計(jì)治療藥物以預(yù)防或減輕 HCM 的病理重塑精置。

RESULTS

Single-nucleus and spatial transcriptomic sequencing of the cardiac IVS tissues from HCM patients and healthy donors

如圖 ，

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收集了接受手術(shù)心肌切除術(shù)的 HCM 患者的心臟 IVS 組織用于 snRNA-seq（n=10锣杂；10 個(gè)樣本）和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（n=3脂倦；4 個(gè)組織切片番宁，其中 HCM1220B 和 HCM1220C 是來(lái)自同一患者）。作為對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)HEALTHY）赖阻，來(lái)自心臟移植健康供體的心臟IVS組織（n=2蝶押；3個(gè)樣本，其中HEALTHY1A和HEALTHY1B來(lái)自同一供體）也進(jìn)行snRNA-seq火欧。對(duì)照組與 HCM 組（中國(guó)人棋电，男性）在種族和性別上匹配。入組受試者的詳細(xì)人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床信息見(jiàn)數(shù)據(jù)補(bǔ)充表 I苇侵。質(zhì)量控制后赶盔，共獲得 55,122 個(gè)細(xì)胞核（HCM：39,183；健康：15,939）（數(shù)據(jù)補(bǔ)充中的表 II）榆浓。對(duì)于空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)于未，在四個(gè)切片上檢測(cè)到 3,339 至 4,849 個(gè)點(diǎn)位于組織上方。

Significant expansion of vascular-related lineages and contraction of cardiomyocytes, fibroblasts and myeloid cells in HCM

基于為每個(gè)譜系建立的標(biāo)記的表達(dá)哀军，如圖

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通過(guò)來(lái)自?xún)煞N條件的 snRNA-seq 數(shù)據(jù)的聯(lián)合聚類(lèi)沉眶，共鑒定了 9 種細(xì)胞類(lèi)型：血管內(nèi)皮細(xì)胞（vEC，由 VWF 標(biāo)記）杉适，成纖維細(xì)胞（FB谎倔，由 PDGFRA 標(biāo)記），心肌細(xì)胞（CM猿推，由 TNNT2 標(biāo)記）片习， 周細(xì)胞（KCNJ8 標(biāo)記）、骨髓細(xì)胞（C1QA 標(biāo)記）蹬叭、平滑肌細(xì)胞（SMC藕咏，MYH11 標(biāo)記）、淋巴細(xì)胞（IL7R 標(biāo)記）秽五、神經(jīng)元細(xì)胞（NRXN1 標(biāo)記）和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（lEC孽查，標(biāo)記為 MYH11） MMRN1)。 通過(guò)比較兩種條件下 UMAP 空間中的細(xì)胞核密度坦喘，可以發(fā)現(xiàn) HCM 中細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)比例發(fā)生了顯著變化盲再，特別是對(duì)于 vEC、周細(xì)胞和心肌細(xì)胞 （細(xì)胞marker我們做研究的有必要收集一下瓣铣，下面的圖如何繪制答朋，大家可以參考我之前分享的文章密度散點(diǎn)圖的繪制（畫(huà)圖基本知識(shí)））棠笑。

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接下來(lái)梦碗，我們量化了兩種條件之間細(xì)胞組成的變化（這個(gè)是很常見(jiàn)的單細(xì)胞分析思路）

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為了確定這些變化是否是偶然的，進(jìn)行了基于排列的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（差異比例分析；DPA）洪规。血管相關(guān)譜系包括 vEC印屁、周細(xì)胞和 SMC 顯著擴(kuò)大（P 值 < 0.05，DPA 測(cè)試）斩例，這與 HCM 中血管生成增加的知識(shí)一致库车。 心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞顯著收縮（P 值 < 0.05樱拴，DPA 測(cè)試），這可能反映了 HCM 中細(xì)胞死亡的增加洋满。

下圖顯示了每個(gè)譜系的不同分子特征晶乔。

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Cardiomyocyte-specific regulatory changes in the pathological cardiac remodeling of HCM

無(wú)偏聚類(lèi)將心肌細(xì)胞分為兩個(gè)亞群：CM1 和 CM2（下圖，這個(gè)聚類(lèi)結(jié)果其實(shí)挺差的牺勾，一般條件下認(rèn)為這樣的結(jié)果是不對(duì)的正罢，但是，我們不能主觀臆斷）

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CM2 表達(dá)高水平的maladaptive markers驻民，表明胎兒基因程序的重新激活翻具，例如 NPPB（編碼利鈉肽 B，一種臨床上用于心力衰竭的生物標(biāo)志物）和 ACTA1（編碼骨骼α-肌動(dòng)蛋白）回还，因此代表了心肌細(xì)胞的衰竭狀態(tài)

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CM1 表達(dá)高水平的 FGF12 和 CORIN裆泳，這可能代表處于相對(duì)穩(wěn)態(tài)或代償性肥大狀態(tài)的心肌細(xì)胞。 與此一致柠硕，CM2 在 HCM 中顯著擴(kuò)大工禾，而 CM1 顯著收縮

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接下來(lái)，使用 DEsingle（關(guān)于這個(gè)R包蝗柔，大家可以參考文章2019-04-17R包DEsingle）闻葵，檢測(cè)了每個(gè)譜系中 HCM 與 HEALTHY 中差異表達(dá)的基因。 對(duì)于心肌細(xì)胞癣丧，2,021 個(gè)基因顯著上調(diào)槽畔，486 個(gè)基因顯著下調(diào)（log2 倍數(shù)變化的絕對(duì)值 >1，調(diào)整后的 P 值 < 0.05）胁编。 In agreement with the pathological hypertrophy phenotype of HCM, the upregulated genes were enriched for terms associated with cell growth and protein synthesis (e.g., “Ribosome assembly” and “Translation”), energy metabolism (e.g., “Oxidative phosphorylation”), stress response (e.g., “Cellular responses to stress”), immune response (e.g., “Antigen processing and presentation”), cell death (e.g., “Regulation of programmed cell death”), metabolic reprogramming (e.g., “Organonitrogen compound metabolic process”), as well as contraction(e.g., “Cardiac muscle contraction”;）

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通過(guò)基因集富集分析 (GSEA) 進(jìn)一步探索了每個(gè)譜系中失調(diào)的通路厢钧，通過(guò)在通路水平上穩(wěn)健地檢測(cè)一致差異來(lái)促進(jìn)生物學(xué)解釋。

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如上圖所示掏呼，除了上述通過(guò)功能富集分析確定的通路外坏快，GSEA分析揭示了更多在 HCM 心肌細(xì)胞中上調(diào)的通路，例如憎夷，“NOTCH2 激活和信號(hào)傳遞到細(xì)胞核”莽鸿，這支持了心肌肥厚中的 NOTCH 信號(hào)傳導(dǎo)。此外，使用 bigScale2 （bigScale2也是一個(gè)處理單細(xì)胞數(shù)據(jù)的軟件,不過(guò)方法有點(diǎn)老祥得，大家可以參考文章科學(xué)家開(kāi)發(fā)出對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模分析的新型工具—BigSCale（2））中實(shí)現(xiàn)的方法兔沃，針對(duì)每個(gè)條件分別構(gòu)建每個(gè)譜系的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) (GRN)。對(duì)每個(gè)譜系進(jìn)行 HCM 和 HEALTHY 之間 GRN 的比較分析（差異調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析级及；DRN 分析）乒疏，并根據(jù)中心性的變化對(duì)基因進(jìn)行排序，即 GRN 中的生物學(xué)重要性饮焦。分析顯示了兩種條件下心肌細(xì)胞的 GRN怕吴，鑒定并標(biāo)記了中心性變化很大的代表性基因，如 CRYAB（Crystallin Alpha B）县踢、EIF1（真核翻譯起始因子 1）转绷、S100A1（S100 鈣結(jié)合）蛋白 A1)、PROS1（蛋白 S）硼啤、TGFB2（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 Beta 2）和 CREB5（CAMP 響應(yīng)元件結(jié)合蛋白 5）议经。

Transcriptomic dynamics during the transition towards the failing state of cardiomyocytes in HCM

為了破譯心肌細(xì)胞向衰竭狀態(tài)過(guò)渡期間的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)并確定減輕 HCM 心力衰竭進(jìn)展的潛在目標(biāo)，我們使用 Slingshot 通過(guò)心肌細(xì)胞核的偽時(shí)間排序重建了軌跡 （Slingshot是一個(gè)做單細(xì)胞軌跡分析的軟件谴返，但是軟件相對(duì)較老煞肾，大家可以參考文章單細(xì)胞軌跡（擬時(shí)間）分析軟件方法選擇指導(dǎo)原則）

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CM2的衰竭心肌細(xì)胞在相對(duì)較晚的假時(shí)間排序

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兩種條件的偽時(shí)間分布存在顯著差異（這個(gè)地方還是要提醒大家一下，但細(xì)胞軌跡分析并不是把樣本都整合起來(lái)分析更好嗓袱，不同條件下分開(kāi)樣本進(jìn)行分析更能體現(xiàn)出軌跡差異籍救，結(jié)果更好）

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然后，使用tradeSeq渠抹，沿著兩種條件之間的軌跡具有顯著不同表達(dá)模式的基因被識(shí)別并聚類(lèi)為7個(gè)基因cluster（這個(gè)方法類(lèi)似于monocle2的軌跡分化熱圖）

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值得注意的是钧忽，適應(yīng)不良標(biāo)記 NPPB 和 NPPA 位于最后一個(gè)基因cluster (VII) 內(nèi)。 接下來(lái)逼肯，根據(jù)三個(gè)獨(dú)立分析的結(jié)果對(duì)候選靶基因進(jìn)行優(yōu)先排序耸黑，包括沿軌跡表達(dá)模式的差異（調(diào)整后的 P 值 < 0.05）、條件之間表達(dá)水平的倍數(shù)變化（log2 的絕對(duì)值） 倍數(shù)變化 > 1)篮幢，以及 GRN 的中心性變化（DRN 等級(jí) < 1000）大刊。 僅考慮編碼轉(zhuǎn)錄因子 (TF)初狰、配體和受體的基因扩劝。

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上圖顯示了優(yōu)先考慮的 14 個(gè)候選基因。 對(duì)于大多數(shù)基因章喉，以前尚未認(rèn)識(shí)到在 HCM 中心肌細(xì)胞向衰竭狀態(tài)轉(zhuǎn)變中的作用搜锰，例如 FGF12（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 12）伴郁、CREB5、BDNF（腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）蛋叼、IL31RA（白細(xì)胞介素 31 受體 A )焊傅、NRXN3 (neurexin 3)剂陡、TGFB2 和 PROS1 (下圖)。

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• 注：Smoothed expression curves of representative candidate targets along the trajectory in both conditions.

Notably, some of them, e.g., FGF12, IL31RA and PROS1 were significantly upregulated in the cardiac tissues of HCM (q-value < 0.05) according to the results of bulk RNA-seq previously performed by our lab, further reflecting their roles in the pathogenesis of HCM.

Fibroblast-specific regulatory changes in the pathological cardiac remodeling of HCM

通過(guò)無(wú)偏聚類(lèi)確定了四個(gè)成纖維細(xì)胞亞群：KCNMB2^highFB1狐胎、NRXN3^highFB2鸭栖、 CNTNAP2^highFB3 和 CD55^highFB4

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值得注意的是，F(xiàn)B2 表達(dá)了最高水平的活化成纖維細(xì)胞（以前稱(chēng)為肌成纖維細(xì)胞）的標(biāo)志物握巢，例如 CCN2晕鹊、FN1、COL1A1暴浦、COL3A1 和 MYH10溅话，因此代表了成纖維細(xì)胞的活化狀態(tài)。 層次聚類(lèi)揭示了 FB1 和 FB2 之間的密切關(guān)系

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因此FB1可能代表靜止的成纖維細(xì)胞狀態(tài)歌焦。 與此一致公荧，F(xiàn)B2 顯著擴(kuò)大，而 FB1 在 HCM 與 HEALTHY 中顯著收縮

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接下來(lái)同规，檢測(cè)兩種條件下成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。與 HCM 中發(fā)生的纖維化一致窟社，纖維化相關(guān)terms券勺，如“細(xì)胞外基質(zhì)組織”和“細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 刺激的反應(yīng)”在上調(diào)基因中富集。

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此外灿里，上調(diào)基因還豐富了與蛋白質(zhì)翻譯和加工关炼、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及免疫反應(yīng)相關(guān)的terms匣吊。值得注意的是儒拂，Hedgehog signaling和 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 信號(hào)也得到了豐富，這與它們?cè)谄渌M織和疾病條件下已知的纖維發(fā)生中的作用一致色鸳。此外社痛，GSEA 揭示了更全面的在 HCM 成纖維細(xì)胞中上調(diào)的信號(hào)通路列表，包括經(jīng)典的促纖維化信號(hào)通路（例如命雀，“TGF BETA 信號(hào)通路”和“WNT 信號(hào)通路”）和細(xì)胞表面 ECM 受體通路（例如蒜哀，“ SYNDECAN 1 途徑”和“INTEGRIN A4B1 途徑”）。此外吏砂，通過(guò)DRN分析檢測(cè)到的中心性變化較大的前5個(gè)基因包括ADAM19（ADAM金屬肽酶結(jié)構(gòu)域19）撵儿、RUNX1（RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子1）、CTIF（帽結(jié)合復(fù)合物依賴(lài)性翻譯起始因子）狐血、MEOX1（mesenchyme homeobox 1) 和 FGF7

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Transcriptomic dynamics during the activation of fibroblasts in HCM

為了破譯成纖維細(xì)胞活化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)并確定減輕 HCM 心臟纖維化的候選治療靶點(diǎn)淀歇，我們通過(guò) FB1 和 FB2 細(xì)胞核的偽時(shí)間排序重建了成纖維細(xì)胞活化的軌跡

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活化的成纖維細(xì)胞 FB2 排列在軌跡的末端

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HCM 成纖維細(xì)胞的偽時(shí)間分布與 HEALTHY 顯著不同

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接下來(lái)，沿著兩種條件之間的軌跡表現(xiàn)出顯著不同表達(dá)模式的基因被識(shí)別并聚類(lèi)為7個(gè)基因cluster

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然后匈织，我們根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)候選目標(biāo)基因進(jìn)行優(yōu)先排序浪默。 下圖顯示了優(yōu)先考慮的 28 個(gè)候選基因。

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值得注意的是，排名靠前的候選基因包括 TF 基因浴鸿，例如 RUNX1井氢、MEOX1、LEF1（淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子 1）和 AEBP1（AE 結(jié)合蛋白 1）岳链，它們?cè)?HCM 與 HEALTHY 中沿成纖維細(xì)胞活化的軌跡顯著上調(diào)

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此外花竞，bulk RNA-seq的結(jié)果表明，一些基因掸哑，如AEBP1约急、LEF1、NRXN3和GLIS1苗分，在HCM的心臟組織中顯著上調(diào)厌蔽，進(jìn)一步反映了它們?cè)贖CM發(fā)病機(jī)制中的作用。

The subpopulations of the immune and vascular lineages and their proportional changes in HCM（免疫細(xì)胞）

Unbiased clustering revealed 8 immune subpopulations（聚類(lèi)圖都挺丑的）

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The subpopulations immune_c0, c1, c4, c5 and c6 expressed high levels of CD68

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thus representing five subpopulations of macrophages (which were referred to as MAC1-5 hereafter).

As shown in 下圖, FGF13^high MAC1 and IGSF21^high MAC2 expressed high levels of LYVE1, which marked for vessel-associated resident macrophages with M2-like phenotypes.

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MAC5 表達(dá)高水平的 FCN1摔癣，這標(biāo)志著促炎巨噬細(xì)胞奴饮。Differential proportional analysis顯示 MAC2 顯著擴(kuò)張和 MAC1 收縮（下圖；P 值 234 < 0.05择浊，DPA 測(cè)試）戴卜，因此 MAC2 代表了一種更活躍的狀態(tài)compared to MAC1。

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功能富集分析和 GSEA 都支持 HCM 中巨噬細(xì)胞的免疫激活琢岩。 除了一小簇 B 細(xì)胞核（由 CD79A 標(biāo)記）外投剥，還鑒定了另外兩個(gè)密切相關(guān)的淋巴譜系亞群：immune_c2 和 Immuno_c3。 Immune_c2 表達(dá)高水平的 T 細(xì)胞標(biāo)志物 CD3D 并表現(xiàn)出高幼稚評(píng)分担孔，因此代表幼稚 T 細(xì)胞的細(xì)胞核江锨。 Immune_c3 表達(dá)高水平的 T 細(xì)胞標(biāo)志物 CD3D 和自然殺傷 (NK) 細(xì)胞標(biāo)志物 NCR1，并表現(xiàn)出高細(xì)胞毒性評(píng)分糕篇，因此代表效應(yīng) T/NK 細(xì)胞核的混合物啄育。 正如分析的那樣，我們觀察到效應(yīng) T/NK 核的顯著擴(kuò)張和naive T 核的顯著收縮拌消。

對(duì)于 vEC 譜系灸撰，確定了在 UMAP 空間中連續(xù)對(duì)齊的 7 個(gè)亞群

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從 UMAP1 的左到右，根據(jù)建立的標(biāo)記拼坎，亞群被分配到動(dòng)脈 ECs（以 SEMA3G 和 DLL4 為標(biāo)記浮毯；動(dòng)脈 EC2 和動(dòng)脈 EC1）、毛細(xì)血管 ECs（以 RGCC 和 CA4 標(biāo)記泰鸡；capEC3债蓝、capEC1、免疫 EC 和 capEC2）和靜脈 EC（由 ACKR1 和 NR2F2 標(biāo)記盛龄；venousEC）饰迹。

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除 capEC1 和 venousEC 外芳誓，大多數(shù)亞群均出現(xiàn)顯著擴(kuò)張（P 值 < 0.05，DPA 測(cè)試）

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對(duì)于 SMC啊鸭，鑒定出具有不同表達(dá)譜的兩個(gè)亞群：SMC1 和 SMC2

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與 SMC1 相比锹淌，SMC2 表達(dá)較低水平的收縮標(biāo)記，如 CNN1 和 TAGLN赠制，并且與 UMAP 空間中的pericytes緊密對(duì)齊赂摆。

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這些結(jié)果表明 SMC2 可能代表了在 HCM 中大大擴(kuò)張的小血管系統(tǒng)的血管 SMC。 與此一致钟些，觀察到 SMC2 的顯著擴(kuò)展

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對(duì)于周細(xì)胞烟号，確定了三個(gè)亞群：pericyte1、pericyte2 和 pericyte3政恍，觀察到 pericyte2 的擴(kuò)展汪拥。

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基于 UMAP 空間的排列，亞群 pericyte2 與 SMCs 密切相關(guān)篙耗，這可能代表了毛細(xì)血管周?chē)哂休^大口徑的周細(xì)胞迫筑。值得注意的是，就像在心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中觀察到的一樣宗弯，能量代謝和免疫反應(yīng)相關(guān)通路在所有三種細(xì)胞類(lèi)型中都被上調(diào)脯燃。

Intercellular communication changes in the cardiac tissue of HCM inferred from the snRNA-seq data（細(xì)胞交流）

迄今為止，HCM 中的細(xì)胞間相互作用主要通過(guò)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)行表征罕伯。 基于 snRNA-seq 數(shù)據(jù)，CellChat （關(guān)于CellChat分析細(xì)胞通訊叽讳，大家可以參考我之前分享的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析之CellChat追他、10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析CellChat之多樣本通訊差異分析）用于分別推斷每個(gè)條件下體內(nèi)亞群之間的配體-受體相互作用。 通過(guò)模式識(shí)別方法岛蚤，針對(duì)每種條件檢測(cè)到每個(gè)亞群的主要傳入和傳出信號(hào)模式邑狸，屬于同一譜系的亞群具有更多相似的模式。 HCM 中推斷的相互作用總數(shù)和強(qiáng)度顯著增加涤妒，反映了在其他疾病中報(bào)道的疾病條件下細(xì)胞間通訊的增強(qiáng)单雾。

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成纖維細(xì)胞亞群的傳出和傳入信號(hào)的相互作用數(shù)量和強(qiáng)度都有很大增加，反映了它們?cè)?HCM 病理重塑中的核心作用她紫。

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值得注意的是硅堆，神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)出來(lái)自其他譜系（例如成纖維細(xì)胞）的顯著增強(qiáng)的傳入信號(hào)。 值得注意的是贿讹，心肌細(xì)胞渐逃，尤其是失敗的 CM2 亞群，表現(xiàn)出與自身（自分泌）和其他一些譜系（旁分泌）（例如巨噬細(xì)胞）的交流減少（下圖）民褂。

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接下來(lái)茄菊，我們比較了兩種條件下每個(gè)信號(hào)通路的相對(duì)信息流疯潭，并確定了在 HCM 中大大增強(qiáng)的通路（例如，PTN面殖、ITGB2竖哩、CSF、PROS脊僚、ICAM相叁、CD46、TGFb吃挑、MHC-1钝荡、ESAM 和 WNT）或特定于 HCM 條件（例如，PARs舶衬、ANGPTL 和 SPP1）埠通。

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通過(guò)推斷通信網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)合流形學(xué)習(xí)，基于功能相似性對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行分組

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學(xué)習(xí)聯(lián)合流形中每條通路的歐幾里德距離反映了兩種條件之間相似的功能變化逛犹。 如下圖所示端辱，距離最大的通路是 TGFb 通路。

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與此一致虽画，網(wǎng)絡(luò)中心性分析證實(shí)舞蔽，HCM 中發(fā)送方和接收方的 TGFb 通路發(fā)生了很大變化

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the top sender從 HEALTHY 中的 MAC2 更改為 HCM 中的效應(yīng) T/NK 細(xì)胞， the top receiver從 CM1 更改為 MAC3码撰。 然后渗柿，我們發(fā)現(xiàn) TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2) 是對(duì) HCM 心臟組織中 TGFb 信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)貢獻(xiàn)最大的配體-受體對(duì)

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如下圖展示，HCM 中 TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2) 信號(hào)增強(qiáng)脖岛，成纖維細(xì)胞朵栖、心肌細(xì)胞和 vEC 接收的 TGFB1 旁分泌信號(hào)主要由效應(yīng) T/NK 細(xì)胞、初始 T 細(xì)胞和促炎巨噬細(xì)胞 MAC5 分泌柴梆。

這里我們要總結(jié)一下單細(xì)胞做細(xì)胞通訊的注意點(diǎn)：

1陨溅、首先關(guān)注細(xì)胞通訊配受體對(duì)的數(shù)量變化
2、相同配受體配的強(qiáng)度變化
3绍在、通訊的大類(lèi)劃分
4门扇、配受體對(duì)之間的距離
5、信號(hào)流

Spatially resolved examination of the expression of candidate genes, the activity of HCM-associated pathways and subpopulations by spatial transcriptomics.(空間轉(zhuǎn)錄組的分析)

選擇用于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的四個(gè)組織切片包含具有替代性纖維化和/或彌漫性（間質(zhì)或血管周?chē)├w維化的區(qū)域偿渡，這些區(qū)域通常發(fā)生在 HCM 中臼寄。 HCM1225D 部分的特點(diǎn)是大的替代性纖維化疤痕和間質(zhì)纖維化

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對(duì)于 HCM1221A 部分，間質(zhì)纖維化僅限于靠近心內(nèi)膜的相對(duì)狹窄區(qū)域溜宽，而大多數(shù)區(qū)域代表非纖維化心臟組織脯厨。 HCM1220B 和 HCM1220C 切片的特點(diǎn)是廣泛的彌漫性纖維化。 通過(guò)斑點(diǎn)的無(wú)偏聚類(lèi)坑质，可以將纖維化區(qū)域的spot與非纖維化區(qū)域的spot分開(kāi)合武。 例如临梗，clusterSC0 和 SC1 通常分別代表 HCM1225D 切片上纖維化和非纖維化區(qū)域的spot。（空間數(shù)據(jù)也是要聚類(lèi)的）

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同樣稼跳，其他切片的纖維化和非纖維化斑點(diǎn)簇也被識(shí)別出來(lái)盟庞。 遵循 Seurat 的標(biāo)簽轉(zhuǎn)移工作流程，我們整合了 snRNA-seq 數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)汤善。 CM1 是處于穩(wěn)態(tài)或代償性肥大狀態(tài)（以 FGF12 為標(biāo)志）的心肌細(xì)胞亞群什猖，預(yù)計(jì)定位于非纖維化區(qū)域，而 CM2红淡，處于衰竭狀態(tài)的心肌細(xì)胞亞群（以 NPPB 為標(biāo)志）定位于靠近 纖維化區(qū)域不狮。

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FB1，靜止的成纖維細(xì)胞亞群在旱，主要位于非纖維化區(qū)域摇零，而 FB2，激活的成纖維細(xì)胞亞群桶蝎，位于 309 個(gè)纖維化區(qū)域驻仅。候選靶基因AEBP1、RUNX1登渣、MEOX1和MGP在纖維化區(qū)域高表達(dá)噪服。因此，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)證實(shí)了我們上述 snRNA-seq 分析的結(jié)果胜茧。 接下來(lái)粘优，針對(duì)每個(gè)切片分別鑒定纖維化與非纖維化區(qū)域中失調(diào)的基因和途徑。如下圖所示呻顽，上調(diào)的通路主要參與 ECM 重塑（例如雹顺，“REACTOME_EXTRACELLULAR_MATRIX_ORGANIZATION”和“REACTOME_TRANSLATION”）、纖維化相關(guān)信號(hào)（例如芬位，“KEGG_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY”和“WP_PI3KAKTWAYING_SIGNALING_SIGNALING_SIGNALING”无拗，免疫反應(yīng)等） ”和“WP_IL18_SIGNALING PATHWAY”）带到，而下調(diào)的通路主要涉及收縮（例如昧碉，“KEGG_CARDIAC_MUSCLE_CONTRACTION”）、能量代謝（例如揽惹，“KEGG_OXIDATIVE PHOSPHORYLATION”）和 TP53 介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)（例如被饿，“REACTOME_TRANSULCRIPTIONAL”）。

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下圖表明代表性上調(diào)途徑在纖維化區(qū)域表現(xiàn)出高表達(dá)活性搪搏。

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DISCUSSION

了解疾病條件下的監(jiān)管變化對(duì)于成功的藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要狭握。 通過(guò)使用 snRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，本研究首次全面分析了人類(lèi) HCM 患者心臟組織中表達(dá)譜疯溺、亞群組成和細(xì)胞間通訊的譜系特異性變化论颅。 我們基于多個(gè)獨(dú)立分析優(yōu)先考慮的候選基因可以作為治療靶點(diǎn)哎垦，以預(yù)防或減輕 HCM 的病理重塑。

雖然心臟重塑是由多個(gè)譜系精心策劃的恃疯，但心肌細(xì)胞是心臟病最重要的決定因素漏设。因此，直接針對(duì)心肌細(xì)胞的藥物治療可能是緩解 HCM 病理性肥大或減輕心力衰竭進(jìn)展的最有希望的策略今妄。單核分辨率數(shù)據(jù)使我們能夠檢查體內(nèi) HCM 的心肌細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)變化郑口。功能富集分析和 GSEA 的結(jié)果很好地概括了病理性心臟肥大的已知特征，包括蛋白質(zhì)翻譯增加盾鳞、能量代謝犬性、應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)腾仅、細(xì)胞死亡和收縮乒裆。在通過(guò) DRN 分析中心性發(fā)生很大變化的基因中，一些與心臟肥大或心力衰竭有關(guān)攒砖；例如缸兔，CRYAB (Crystallin Alpha B) 已被證明可抑制小鼠壓力超負(fù)荷 340 誘導(dǎo)的心臟肥大。 S100A1（S100 鈣結(jié)合蛋白 A1）已被建議作為治療心力衰竭的靶點(diǎn)吹艇。然而惰蜜，精確的大多數(shù)基因在 HCM 的發(fā)病機(jī)制中的作用尚未闡明，例如 PROS1 (Protein S) 和 CREB5受神。心肌細(xì)胞分為兩個(gè)亞群：CM1 和 CM2抛猖，分別代表穩(wěn)態(tài)或代償性肥大狀態(tài)和衰竭狀態(tài)。通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)衰竭的心肌細(xì)胞亞群 CM2 靠近纖維化區(qū)域鼻听，這反映了心臟纖維化對(duì) HCM 心肌細(xì)胞的不利影響财著。細(xì)胞間通訊分析顯示，心肌細(xì)胞撑碴，尤其是失敗的亞群 CM2撑教，在 HCM 中表現(xiàn)出與自身（自分泌）和其他一些譜系（旁分泌）的通訊減少，反映了 HCM 中心肌細(xì)胞的通訊功能障礙醉拓。

病理性心臟肥大是心力衰竭的常見(jiàn)前身伟姐。 最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠模型中心臟重構(gòu)的早期（肥大心肌細(xì)胞）和適應(yīng)不良的噬菌體（衰竭心肌細(xì)胞）之間心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，通過(guò)偽時(shí)間排序亿卤，我們確定了人類(lèi)患者 HCM 心肌細(xì)胞向衰竭狀態(tài)過(guò)渡期間的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)愤兵。基于來(lái)自獨(dú)立分析的多條證據(jù)排吴，我們獲得了一系列基因秆乳，這些基因可以作為減輕 HCM 心力衰竭進(jìn)展的潛在醫(yī)學(xué)靶點(diǎn)，并且大多數(shù)基因與心力衰竭或心臟肥大（如 FGF12、IL31RA）無(wú)關(guān), BDNF 和 PROS1屹堰。值得注意的是肛冶，F(xiàn)GF12（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 12）的表達(dá)沿著 HCM 中衰竭狀態(tài)的軌跡下降。最近有報(bào)道 359 FGF12 抑制肺動(dòng)脈高壓中 SMC 的病理重塑扯键。同樣淑趾，我們推測(cè)它可能在 HCM 心肌細(xì)胞的病理重塑中起保護(hù)作用。

心臟纖維化是心臟組織中的瘢痕形成過(guò)程忧陪，其特征在于響應(yīng)病理生理學(xué)刺激而過(guò)度沉積 ECM扣泊。 HCM患者存在高負(fù)荷的心臟纖維化，導(dǎo)致舒張功能障礙嘶摊。心臟纖維化已被證明是 HCM 中 SCD 和心力衰竭等不良結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子延蟹。心臟纖維化是由成纖維細(xì)胞的活化介導(dǎo)的，了解 HCM 中成纖維細(xì)胞活化的調(diào)控機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的藥物治療以減輕心臟纖維化并從而防止 HCM 患者出現(xiàn)不良后果至關(guān)重要叶堆。我們確定了活化的成纖維細(xì)胞亞群 FB2阱飘，正如預(yù)期的那樣，它在纖維化區(qū)域顯著擴(kuò)大和定位虱颗。此外沥匈，基于來(lái)自獨(dú)立分析的多條證據(jù)，我們獲得了用于抗纖維化醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)的候選靶基因忘渔。其中高帖，一些排名靠前的 TF 基因可能代表驅(qū)動(dòng) HCM 或其他纖維化相關(guān)疾病中成纖維細(xì)胞活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。例如畦粮，最近有人提出 RUNX1 是心肌梗塞后心臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子散址。 最近的一項(xiàng)研究表明，MEOX1 調(diào)節(jié)促纖維化功能宣赔，并與包括心臟预麸、肝臟、肺和心臟在內(nèi)的多個(gè)人體器官的纖維化有關(guān)儒将。腎 AEBP1（也稱(chēng)為 ACLP）與肺纖維化的成纖維細(xì)胞活化有關(guān)吏祸。然而，我們的研究還確定了一系列未明確與纖維化有關(guān)的新基因和通路钩蚊。例如贡翘，LEF1 和 IL18 信號(hào)通路。有趣的是两疚，NRXN3 編碼神經(jīng)蛋白家族的跨膜受體蛋白床估，主要在神經(jīng)元中表達(dá)含滴，主要在精神疾病中討論诱渤，被發(fā)現(xiàn)在活化的成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)，其在心臟纖維化中的確切作用值得進(jìn)一步探索谈况。

越來(lái)越多的證據(jù)表明勺美，免疫細(xì)胞在病理性心臟重塑過(guò)程中協(xié)調(diào)心肌細(xì)胞（如肥大）和其他非心肌細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞活化）的反應(yīng)递胧。 因此，確定與疾病相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群并開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)心臟免疫表型的療法細(xì)胞代表了另一種重要的治療策略赡茸，例如缎脾，用工程化 T 細(xì)胞靶向心臟纖維化。 （例如占卧，T/NK 細(xì)胞）免疫遗菠。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)與免疫反應(yīng)相關(guān)的途徑华蜒，例如抗原加工和呈遞辙纬，在所有非免疫細(xì)胞類(lèi)型中都被上調(diào)，反映了 HCM 中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)叭喜。 TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)不僅在疾病中具有許多多效性作用贺拣，例如在病理性心臟重構(gòu)中促進(jìn)心臟肥大和纖維化，而且在組織穩(wěn)態(tài)中也具有多效性捂蕴。雖然 TGF-β 阻斷可能是一種有前景的治療策略譬涡，但直接和過(guò)度抑制 TGF-β 可能導(dǎo)致基質(zhì)降解、心臟擴(kuò)張和功能障礙啥辨。通過(guò)細(xì)胞間通訊分析涡匀，我們發(fā)現(xiàn) TGF-β 的最高發(fā)送者從 HEALTHY 中的 MAC2 改變HCM 中的效應(yīng) T/NK 細(xì)胞，這表明抑制 T/NK 細(xì)胞的活化可以減弱 TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)溉知，從而減輕 HCM 的病理重塑渊跋，同時(shí)避免直接 TGF-β 阻斷的有害影響。

在本研究中着倾，健康組（n=2）的受試者人數(shù)少于 HCM 組（n=10）拾酝。 這可能會(huì)限制比較分析的統(tǒng)計(jì)能力。 將包括額外的對(duì)照樣本以解決后續(xù)研究中的這一限制卡者。 此外蒿囤，在我們實(shí)驗(yàn)室后續(xù)功能研究的候選靶標(biāo)的優(yōu)先排序中，僅考慮了 TF崇决、配體和受體材诽； 然而，其他類(lèi)型的分子恒傻，例如激酶脸侥，也可以作為藥物開(kāi)發(fā)的理想靶點(diǎn)。

總之盈厘，對(duì) HCM 中特定于譜系的監(jiān)管變化進(jìn)行了全面分析睁枕。 文章的分析確定了大量候選治療靶基因和途徑，以預(yù)防或減輕 HCM 的病理重塑。 文章的數(shù)據(jù)集構(gòu)成了在單核和空間分辨率下檢查 HCM 細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)變化的寶貴資源外遇。

Method

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通訊分析

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單細(xì)胞空間聯(lián)合分析

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生活很好注簿，有你更好