前期記錄
先確定目標(biāo)基因
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（1）
然后對目的基因進(jìn)行背景調(diào)查
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（2）磨刀不誤砍柴工
設(shè)計(jì)sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設(shè)計(jì)好之后
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（3）sgRNA及引物設(shè)計(jì)
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（4）構(gòu)建sgRNA+Cas9載體
轉(zhuǎn)染驗(yàn)證
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（5）293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證 and trouble shooting
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（6）正式轉(zhuǎn)染+單克隆細(xì)胞篩選
遇到的困難：WB檢測無表達(dá)
以下是我的基本流程：
1. 買好抗體
2. 確定該細(xì)胞有該蛋白表達(dá)
3. 查閱文獻(xiàn)，確定WB檢測之前不需要特殊處理
4. 使用陽性樣本驗(yàn)證抗體是否可用
5. 大膽做實(shí)驗(yàn)---失敗
不是沒有在驗(yàn)證表達(dá)上吃過虧俏橘，上次吃虧我已經(jīng)吸取到教訓(xùn)饰躲，在WB驗(yàn)證之前醉鳖，仔細(xì)查閱了同樣的細(xì)胞系的該蛋白的表達(dá)情況，并且在RNA-seq數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)了是有一定表達(dá)量的笼恰，至少有PNAS，NC級別的文章驗(yàn)證過該蛋白在該細(xì)胞中的表達(dá)，并且不需要任何預(yù)先處理人乓，所以放心的去做了WB。但是打臉真的是啪啪的知允。首先撒蟀，每個(gè)課題組的情況都不一樣，其次温鸽，所用的試劑耗材未必相同保屯，接著預(yù)處理未必一樣，還有就是別人的結(jié)果我們不一定能重復(fù)出來涤垫，因此在遇到蛋白水平無法檢測的時(shí)候該怎么辦姑尺。
首先，回去再次確認(rèn)文獻(xiàn)信息蝠猬，確認(rèn)蛋白表達(dá)切蟋，并查閱新的文獻(xiàn)--沒查到特殊要求。
使用免疫熒光檢查表達(dá)榆芦。因?yàn)橛行┑鞍自诔Ｒ?guī)情況下表達(dá)量非常低柄粹，這時(shí)候免疫熒光比WB能更好的檢測低表達(dá)樣本。
先刺激蛋白表達(dá)匆绣，再總蛋白驗(yàn)證
說干就干驻右。
