花青素(Anthocyanidin)是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素汪厨，屬于類黃酮化合物低斋。水果、蔬菜匪凡、花卉的顏色大部分與之有關(guān)膊畴。花青素能夠提高植物觀賞價(jià)值病游，花青素的抗氧化功能對人體健康有積極作用唇跨。花青素已被用于健康補(bǔ)充劑的成分衬衬。因此买猖，培育高含量花青素的植物是一個(gè)重要目標(biāo)。

近日滋尉，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室玉控、齊魯師范大學(xué)玉米分子育種研究院的共同研究成果，于2022年7月5日在國際知名學(xué)術(shù)期刊Theoretical and Applied Genetics上發(fā)表(影響因子為5.574)狮惜，題目為“ A newly characterized allele of ZmR1 increases anthocyanin content in whole maize plant and the regulation mechanism of diferent ZmR1 alleles”高诺。本文主要研究內(nèi)容是鑒定了玉米花青素合成相關(guān)等位基因ZmR1CQ01，并揭示了3個(gè)ZmR1等位基因的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制碾篡。

研究背景

玉米中的花青素對人類的健康具有積極作用虱而。R1基因家族調(diào)控花青素的組織特異性分布。R1基因的等位基因變異較為豐富开泽，然而其生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚牡拇。

研究材料

玉米自交系 CQ01、ZN3穆律、B73惠呼、B104、WMR峦耘，京紫糯219 (ZN3×CQ01)罢杉，京724，京92贡歧、京科968 (京724×京92)滩租，B73?zmr1?EMS突變體，以及本研究中用到的多個(gè)遺傳材料利朵。

研究結(jié)果

CQ01玉米植株的多種器官(葉鞘律想、葉脈、苞片绍弟、葉技即、莖、種子皮樟遣、支撐根等) 中都存在花青素色素沉著現(xiàn)象而叼。然而B73植株的花青素主要積累在近地葉鞘和支撐根中身笤。

圖1：玉米自交系CQ01葉片中脈花青素含量和成分分析以及花青素調(diào)控基因的定位

(a)玉米自交系CQ01和B73的葉中脈。(b) CQ01生長30天后葉中脈的花青素含量葵陵。(c) LC-MS/MS在不同掃描波長下的信號(hào)強(qiáng)度液荸。(d) LC-MS/MS檢測花青素的保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度。(e) 花青素組成成分檢測脱篙。(f)BSR-seq分析將花青素調(diào)控基因定位到10號(hào)染色體 (B73 RefGen_v3)娇钱。(g) 采用滑動(dòng)窗口法將花青素調(diào)控基因定位到10號(hào)染色體132-140Mb區(qū)間。(h) 利用CQ01(紫色中脈)和ZN3(綠色中脈)之間具有SNP多態(tài)性的13個(gè)KASP分子標(biāo)記绊困，對465個(gè)京紫糯219 (ZN3×CQ01)的F2代個(gè)體進(jìn)行精細(xì)定位文搂，將葉中脈花青素調(diào)控基因定位于KASP-15和KASP-19標(biāo)記之間的404kb區(qū)間。

通過CQ01和B73雜交的F2代種群分離實(shí)驗(yàn) (綠色中脈:紫色中脈=1:3) 發(fā)現(xiàn)秤朗，CQ01的紫色葉中脈由一個(gè)顯性基因控制煤蹭。通過BSR-seq分析及精細(xì)遺傳定位發(fā)現(xiàn)玉米葉中脈的花青素色素沉著由第10號(hào)染色體上的ZmR1基因控制。

圖2：過表達(dá)ZmR1和過表達(dá)ZmR1CQ01的京724的不同組織中花青素的積累

(a) ZmR1過表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)取视。(b) 野生型京724和5個(gè)獨(dú)立的過表達(dá)ZmR1CQ01的京724(T0代)中花青素積累的表現(xiàn)型疯兼。(c-m) 野生型京724和過表達(dá)ZmR1CQ01的京724的不同組織中的花青素積累∑锻荆花青素在玉米粒(c)吧彪、胚芽鞘(d和e)、玉米須(f和j)丢早、苞片(f和j)姨裸、葉(g和k)、葉中脈(g和k)怨酝、葉鞘(h和l)傀缩、莖(h和l)、花藥(i和m)和雄花序(i和m)中積累农猬。

ZmR1CQ01是從紫色玉米中獲得的一個(gè)新的ZmR1等位基因赡艰。該基因的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)玉米植株變成紫色。

圖3：玉米zmr1?EMS突變體的等位基因檢測及ZmR1的亞細(xì)胞定位

(a) 3個(gè)B73?zmr1?EMS突變體的突變位點(diǎn)和核苷酸變異情況斤葱。(b) 突變位點(diǎn)測序結(jié)果慷垮。(c-d) 野生型B73、3個(gè)B73?zmr1?EMS突變體(c)揍堕、2個(gè)突變體雜交植株和CQ01(d)的葉鞘中花青素積累的情況料身。(e) 通過對玉米原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)分析ZmR1的亞細(xì)胞定位。

玉米zmr1?EMS突變體的等位基因檢測表明衩茸，葉鞘中的花青素色素沉著也受到ZmR1的控制芹血。

圖4：玉米自交系B73的葉鞘和葉片中花青素的積累和ZmR1的表達(dá)，以及在B104中過表達(dá)ZmR1B73后，葉中脈花青素積累增加

(a-b) B73和CQ01在葉鞘(a)和中脈(b)中的花青素積累幔烛。(c) B73生長30天后葉鞘中花青素的含量啃擦。(d)在生長30天的B73、CQ01和B73?zmr1?EMS突變體的葉鞘(靠近地面)饿悬、葉片和中脈中ZmR1的表達(dá)水平令蛉。(e)通過轉(zhuǎn)錄組分析鑒定生長30天的CQ01和B73葉中脈中ZmR1的FPKM值。(f) 生長30天的野生型B104和過表達(dá)ZmR1B73的轉(zhuǎn)基因B104中花青素色素沉著的比較乡恕。(g-h) 過表達(dá)ZmR1B73的轉(zhuǎn)基因B104和過表達(dá)ZmR1CQ01的轉(zhuǎn)基因B104在生長30天時(shí)花青素色素沉著的比較。

ZmR1B73等位基因調(diào)控花青素在近地葉鞘中積累俯萎，而在葉片中脈沒有積累傲宜。ZmR1B73在中脈的mRNA表達(dá)水平較低，因而沒有花青素積累夫啊。過表達(dá)ZmR1B73可以促進(jìn)花青素在中脈的積累函卒。

圖5：ZmR1ZN3的功能驗(yàn)證和功能分子標(biāo)記物的開發(fā)

(a) 花青素不在ZN3的葉鞘和中脈積累。(b) 生長30天的ZN3和CQ01的葉片撇眯、中脈和葉鞘中ZmR1的表達(dá)量比較报嵌。(c) 通過zmr1?EMS突變體等位基因測試驗(yàn)證ZmR1ZN3的功能。(d) ZN3和CQ01的序列比對顯示熊榛，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個(gè)外顯子锚国。(e)?ZmR1可編碼三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中bHLH-MYCN結(jié)構(gòu)域由第5個(gè)外顯子編碼玄坦。(f) CQ01血筑、ZN3和京紫糯219 (ZN3×CQ01)中分子標(biāo)記的擴(kuò)增片段大小。CQ01為315 bp煎楣，ZN3為272 bp豺总，京紫糯219為272 bp和315 bp。(g) 玉米自交系WMR的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與觀察到的表型一致择懂。利用所開發(fā)的分子標(biāo)記喻喳，對432個(gè)田間玉米自交系進(jìn)行了鑒定。WMR的擴(kuò)增片段為272 bp困曙。表型分析顯示表伦，WMR的葉鞘和中脈缺乏花青素的積累。

對ZN3和CQ01的序列比較顯示慷丽，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個(gè)外顯子绑榴，導(dǎo)致ZmR1ZN3等位基因功能被破壞，因而在中脈和葉鞘中沒有花青素積累盈魁。

圖6：DAP-seq鑒定的ZmR1靶基因和RNA-seq鑒定的差異表達(dá)基因(DEGs)富集的代謝途徑

(a)ZmR1結(jié)合的置信度高的兩種motifs,“GATCAATGGCCA”和“GAGGWGTMBGWG”的motifs E值分別是 4.6e-311和1.3e-268翔怎。(b) 由DAP-seq鑒定的ZmR1的靶基因富集的前20個(gè)代謝途徑。(c) RNA-seq分析CQ01和B73的中脈，鑒定了DEGs富集的前20個(gè)代謝途徑赤套。(d) RNA-seq分析野生型和過表達(dá)ZmR1CQ01的京724的葉片飘痛，鑒定了DEGs富集的前20個(gè)代謝途徑。

DNA親和純化測序(DAP-seq)結(jié)果顯示容握，ZmR1CQ01靶向了1010個(gè)基因宣脉，其中包括花青素合成途徑中的Bz2。RNA-seq分析顯示剔氏，ZmR1CQ01靶向的55個(gè)基因的表達(dá)水平顯著改變塑猖，其中類黃酮和苯丙素生物合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)顯著上調(diào)。隨后谈跛，又開發(fā)了ZmR1功能分子標(biāo)記物羊苟。以上結(jié)果揭示了轉(zhuǎn)錄調(diào)控和序列變異對ZmR1功能的影響，并在全基因組水平上鑒定了ZmR1CQ01的靶基因感憾。

圖7：過表達(dá)ZmR1CQ01玉米京724的應(yīng)用

(a) 過表達(dá)ZmR1CQ01京724植株由綠色變?yōu)樽仙?b)過表達(dá)ZmR1CQ01京724的紫色玉米將白酒變?yōu)榧t色蜡励。(c) 過表達(dá)ZmR1CQ01京724和京92雜交得到的田間玉米雜交種京科968植株是紫色的。

本文小結(jié)

本研究在玉米自交系CQ01的葉中脈中克隆了新的ZmR1等位基因阻桅。通過利用玉米EMS突變體凉倚、過表達(dá)ZmR1基因、分析序列差異嫂沉、組織特異性表達(dá)分析稽寒、啟動(dòng)子甲基化水平分析、轉(zhuǎn)錄組和DAP-seq結(jié)果趟章，揭示了ZmR1在多種組織中對花青素分布的影響及其分子調(diào)控機(jī)制瓦胎。

通過分子育種策略，可以產(chǎn)生高花青素含量的玉米品系尤揣。過表達(dá)ZmR1CQ01搔啊，獲得了一個(gè)花青素含量高的紫色玉米雜交種京科968。本研究開發(fā)的新R等位基因ZmR1CQ01及其功能分子標(biāo)記北戏，可通過分子標(biāo)記輔助育種用于高花青素含量玉米新品種的遺傳改良和分子設(shè)計(jì)育種负芋。

藍(lán)景科信河北生物科技有限公司為作者提供了DAP-seq技術(shù)支持。