【上一篇為大家介紹了TASS的生物學功能以及研究方法，本篇繼續(xù)為大家介紹IV分泌系統(tǒng)的效應(yīng)底物以及轉(zhuǎn)移方式】
上海唯那生物：Type IV secretion system, T4SS知識介紹1zhuanlan.zhihu.com
結(jié)構(gòu)組成
T4SS最少由一組保守的亞基組成胧华。在革蘭氏陰性菌中浸锨，需要約12個亞基來構(gòu)建功能齊全的“minimized”系統(tǒng)。根據(jù)來自典型根癌土壤桿菌VirB/VirD4 T4SS的T4SS超家族(T4SS superfamily )的統(tǒng)一命名法，這些被命名為VirB1-VirB11和VirD4.
①?三種ATP酶（VirD4柬泽，VirB4，VirB11）構(gòu)成位于易位通道底部的細胞質(zhì)能量中心嫁蛇，也就是定位于內(nèi)膜并作為為系統(tǒng)供電的ATP酶锨并，在這些ATP酶中，VirD4在進入轉(zhuǎn)移通道之前充當DNA和蛋白質(zhì)底物結(jié)合的受體睬棚，轉(zhuǎn)運的 DNA 呈遞給分泌系統(tǒng)的其他組分第煮。
② 通道本身由兩個子組件組成解幼，一個組件跨越內(nèi)膜（inner membrane,IM），另一個組件位于周質(zhì)和外膜（outer membrane ,OM）中包警。
③?IM復合物（IM complex,IMC）最少由VirB3撵摆，VirB6，VirB8和VirB10的N-末端區(qū)域組成害晦。與通道穩(wěn)定結(jié)合的VirB4 ATP酶也被認為是IMC的一部分特铝。
④ IMC通過莖或圓柱體連接到外膜核心復合物（outer membrane core complex,OMCC），其最小程度地由脂蛋白VirB7壹瘟，VirB9和VirB10的C末端( C-terminal)結(jié)構(gòu)域組成.
T4SS底物和轉(zhuǎn)移信號 (T4SS substrates and translocation signals)
關(guān)鍵詞：Dtr proteins（MOB） 鲫剿、relaxosome、 IV型偶聯(lián)蛋白（type IV coupling proteins稻轨，T4CP）灵莲、轉(zhuǎn)移信號（translocation signals，TSs）
VirD4 receptors and substrate docking
VirD4受體幾乎與所有的T4SSs相關(guān)殴俱；少數(shù)缺乏VirD4亞單位的系統(tǒng)似乎只在抗原可變（antigenically-variable）菌毛的形成過程或從周質(zhì)向T4SS輸出底物中起作用笆呆。
R388編碼的TrwB是T4CP超家族的結(jié)構(gòu)原型。根據(jù)TrwB的結(jié)構(gòu)和其他生化證據(jù)粱挡，VirD4受體被認為是具有N末端跨膜結(jié)構(gòu)域（NTD）赠幕、保守胞質(zhì)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）和與底物結(jié)合有關(guān)的序列變量全α結(jié)構(gòu)域（AAD）的同六聚體。
一些T4CPs比TrwB（507個殘基）大得多询筏，這是由于在一個或兩個末端存在序列變量擴展榕堰。DotL與嗜肺鏈球菌T4SSDot/Icm相關(guān)，目前是這些較大受體的最佳表征代表嫌套。DotL具有約200個殘基的C-末端結(jié)構(gòu)域（CTD）逆屡，該結(jié)構(gòu)域與T4SSDot/Icm轉(zhuǎn)運效應(yīng)子子所需的銜接蛋白IcmS和IcmW結(jié)合。
在過去三年中踱讨，在確定銜接子(adaptors)和DotL的CTD對效應(yīng)子募集的作用方面取得了重大進展魏蔗。首先，兩組報告了DotL CTD(IcmS and IcmW 與 DotN and LvgA)的晶體結(jié)構(gòu)痹筛。DotN莺治，IcmW，IcmS和LvgA從CTD的N端到C端連續(xù)結(jié)合帚稠。在假設(shè)原子模型中谣旁，DotL全復合物由與鐘形 CTD /adaptor復合物連接的類TrwB同六聚體組成，其被稱為底物受體或識別模塊滋早。在該模型的背景下榄审，通過與不同的銜接蛋白接觸，大多數(shù)或所有效應(yīng)蛋白被募集到DotL T4CP中杆麸。
光交聯(lián)測定（photocrosslinking assays）的結(jié)果證實效應(yīng)子與IcmS/IcmW異二聚體的細長疏水表面接觸搁进。此外浪感，兩組現(xiàn)已報道了DotL/銜接子-效應(yīng)復合物的晶體結(jié)構(gòu)。在一項研究中饼问，提出了與效應(yīng)物VpdB篮撑，SetA，PieA或SidH結(jié)合的DotL/IcmS/IcmW/LvgA復合物的原子結(jié)構(gòu)匆瓜。
值得注意的是赢笨，VpdB的~130個殘基的C-末端片段由5個α-螺旋組成，其中a1與LvgA的疏水口袋形成特異性和廣泛的接觸驮吱，并且a2-a5形成弱結(jié)合LvgA的四螺旋束茧妒。SetA，PieA和SidH的C-末端基序類似地結(jié)合LvgA的疏水口袋左冬。在LvgA疏水口袋的VpdB和SidH（但不是SetA或PieA）的α-螺旋中鑒定出FxxxLxxxK基序桐筏。在生物信息學篩選中，由嗜肺軍團菌菌株P(guān)hiladelphia-1編碼的2930種蛋白質(zhì)中的257種攜帶該基序拇砰，這些46種屬于T4SSDot/Icm的已知效應(yīng)物庫梅忌。因此，該FxxxLxxxK基序可能構(gòu)成用于介導與LvgA的特定接觸的大部分Dot/Icm效應(yīng)子的先前未識別的TS除破。
第二項研究牧氮，DotL/受體復合物的純化產(chǎn)生與DotN，IcmS瑰枫，IcmW和LvgA結(jié)合的DotL踱葛，以及DotM和兩種先前未知的Dot蛋白DotY和DotZ。建模產(chǎn)生了DotL同六聚體/受體（homohexamer/receptor ）模塊的結(jié)構(gòu)光坝，依托于DotM而非IcmS尸诽、IcmW或LvgA進行轉(zhuǎn)移的第二效應(yīng)子集的招募機制提供了新的觀點。這些效應(yīng)子攜帶上述E-嵌段基序盯另，并且與DotM的E-嵌段接觸的建模揭示了效應(yīng)子與DotL/受體復合物結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)性含。總之鸳惯，這些最新發(fā)現(xiàn)大大提高了我們對T4SSDot/Icm通道如何將大量帶有不同TSs的效應(yīng)子進行轉(zhuǎn)移的理解商蕴。
在結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)分泌底物后，VirD4受體如何介導穿過內(nèi)膜或細胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移悲敷？事實上究恤，這仍然是IV型分泌最不了解的方面之一。根據(jù)一個模型后德，VirD4結(jié)合并直接將底物穿梭到周質(zhì)，在那里它們進入VirB通道以通過細胞外部抄腔∑芭龋或者理张，VirD4募集底物，但隨后與VirB4和VirB11 ATP酶協(xié)調(diào)以處理并通過跨越整個細胞包膜的VirB通道遞送它們绵患。對這兩種模型都有實驗支持雾叭，并且由于還沒有研究可視化由與VirB通道結(jié)合的VirD4六聚體組成的完整T4SS，所以區(qū)分它們是復雜的落蝙。事實上织狐，二聚體或未指定形式的VirD4亞基顯示與同源T4SS結(jié)合，但不知道這些機制是否能夠進行轉(zhuǎn)移筏勒。實際上移迫，有大量證據(jù)表明，T4SS在感測到細胞內(nèi)信號（例如底物對接和ATP能量消耗）以及細胞外信號（例如靶細胞結(jié)合）后會經(jīng)歷后期組裝或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變管行。進一步定義這種細胞內(nèi)或細胞外信號如何調(diào)節(jié)通道組裝動力學和底物流動仍然是進一步探索的令人興奮的領(lǐng)域厨埋。
效應(yīng)蛋白
Translocation signals，TSs
TSs定義為通過效應(yīng)轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)識別蛋白質(zhì)底物捐顷，早期荡陷，在C末端發(fā)現(xiàn)了兩種TSs，一種由帶正電荷的簇組成迅涮，另一種由疏水殘基組成废赞。許多效應(yīng)子攜帶這樣的TSs，但實際上叮姑，不同效應(yīng)轉(zhuǎn)運體識別的TSs之間存在很大差異蛹头，如下所示。
首先戏溺，在2015年渣蜗，C.Farah及其同事在黃單胞菌（Xanthomonas citri）中發(fā)現(xiàn)了T4SSs亞家族，該亞家族通過蛋白質(zhì)毒素的轉(zhuǎn)運促進相鄰細菌的殺滅旷祸。所有這些效應(yīng)毒素都攜帶C-近端TSs耕拷，由約120個殘基組成，稱為XVIPCD（Xanthomonas VirD4-interacting protein conserved domain)托享。?X.citri VirB/VirD4 T4SS的效應(yīng)子最初被識別是在與VirD4結(jié)合的蛋白質(zhì)骚烧。然而，作為生物信息學篩選的結(jié)果闰围，帶有XVIPCD基序的候選效應(yīng)子列表超過了數(shù)百個赃绊；分散在許多物種中，以黃單胞菌和其他變形桿菌的順序排列羡榴。XVIPCD的特征在于N-末端區(qū)域和富含Gln的C-末端區(qū)域中的一些保守基序碧查，但尚未指定effector - VirD4 相互作用的性質(zhì)。
在Bartonella spp中，BEP（Bartonella effector proteins）效應(yīng)蛋白在感染期間通過VirB/VirD4 T4SS遞送到真核細胞中忠售。Bep具有稱為BID（Bep intracellular delivery）結(jié)構(gòu)域的C近端TS传惠。BID結(jié)構(gòu)域是序列可變的，但采用由延伸的4-螺旋束組成的保守結(jié)構(gòu)折疊稻扬，其有趣地使人聯(lián)想到由TraM和上述其他Dtr蛋白攜帶的C-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域卦方。這種結(jié)構(gòu)折疊也涉及VirD4結(jié)合，但有趣的是泰佳，給定的效應(yīng)子可以具有分布在整個Bep中的多個BID結(jié)構(gòu)域盼砍。此外，BID結(jié)構(gòu)域可通過結(jié)合和改變蛋白質(zhì)功能在真核宿主細胞中賦予效應(yīng)子功能逝她。例如浇坐，BepA的BID1結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合人腺苷酸環(huán)化酶的催化亞基C2以增強cAMP產(chǎn)生來抑制細胞凋亡，從而增強人內(nèi)皮細胞的增殖汽绢。因此吗跋，至少有一些BID結(jié)構(gòu)域進化出雙重作用，即作為TSs被VirD4受體識別宁昭，以及通過結(jié)合真核細胞靶來幫助感染的效應(yīng)子跌宛。
嗜肺軍團菌Dot/Icm T4SS的早期研究鑒定了許多轉(zhuǎn)移效應(yīng)子（translocated effectors），其含有由短極性和帶負電荷的氨基酸組成的C-末端TSs积仗。生物信息學和實驗方法的組合進一步鑒定了至少100個Dot/Icm效應(yīng)子疆拘，其在C末端的17至10個殘基內(nèi)帶有谷氨酸殘基簇（E嵌段基序，the E block motif）寂曹，并且在末端附近具有一個或多個疏水性氨基酸哎迄。然而，一些具有the E block motif的效應(yīng)子以及缺乏該基序的其他效應(yīng)子的易位可以通過銜接蛋白如iCM和IcmW正向或負向調(diào)節(jié)隆圆。Dot/Icm效應(yīng)子至少有三種方式與T4SSDot/Icm建立關(guān)系漱挚，E嵌段基序，E嵌段基序與銜接子的結(jié)合渺氧，或通過結(jié)合銜接子以及可能除E嵌段基序之外的TS≈祭裕現(xiàn)在已經(jīng)描述了通過與一種或多種銜接蛋白的特異性接觸將潛在的大量效應(yīng)子進入到T4SSDot/Icm通道。
效應(yīng)DNA分子
Relaxosome - VirD4 (T4CP) interactions
T4SS通道將底物遞送穿過細胞膜侣背，但它必須首先將這些底物輸送到細胞質(zhì)入口白华。通過DNA轉(zhuǎn)移和復制蛋白（DNA transfer and replication proteins，Dtr proteins）的將MGE向同源接合或“mating”通道的聚集贩耐，Dtr proteins結(jié)合轉(zhuǎn)移起點（origin-of-transfer弧腥，oriT）序列以形成松弛體（relaxosome）。
以原子分辨率的技術(shù)解決了F質(zhì)粒編碼的TraI松弛酶與其oriT靶序列的相互作用潮太。值得注意的是管搪，TraI含有兩個轉(zhuǎn)移信號（translocation signals，TSs），其序列與由在R388抛蚤，R6112和pKM101質(zhì)粒轉(zhuǎn)移中起作用的松弛酶攜帶的TSs相似台谢。指定為TSA和TSB（Translocation Signals A and B）的這些信號不位于F編碼的TraI或相關(guān)松弛酶的N或C末端寻狂，如分泌蛋白的特征性情況岁经；相反，這兩個TSs映射到C近端解旋酶結(jié)構(gòu)域蛇券，特別是在SF1A/B解旋酶結(jié)構(gòu)折疊的2B/2B樣亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)缀壤。這些TSs可能有助于松弛體與同源VirD4受體（IV型偶聯(lián)蛋白（ type IV coupling proteins，T4CP））的結(jié)合纠亚，但這些相互作用的細節(jié)尚不可用塘慕。
目前的情況是，許多松弛體組分蒂胞，包括松弛酶图呢，Dtr因子，甚至轉(zhuǎn)移DNA（translocated DNA）骗随，必須結(jié)合VirD4蛤织， T4CP才能進行特異性和有效的接合DNA轉(zhuǎn)移。
IV型偶聯(lián)蛋白（type IV coupling proteins鸿染，T4CP）
IV型偶聯(lián)蛋白是異質(zhì)蛋白家族指蚜，具有保守的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-Binding Domain ，NBD）涨椒。幾乎所有的T4CP都由TMD和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成摊鸡。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含NBD，全α結(jié)構(gòu)域（all-alpha domain 蚕冬，AAD）免猾，在某些情況下還包含C-末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）囤热。根據(jù)域的體系結(jié)構(gòu)和性質(zhì)猎提，T4CP分到五個子家族。
VirD4-Type
這是T4CP的第一個描述和研究最多的亞家族赢乓。其名稱由根癌土壤桿菌T質(zhì)粒（VirD4At）的T4CP給出忧侧。TrwBR388是T4CP家族的原型，包含在這個VirD4型子家族中牌芋。VirD4型亞家族包括500-750個殘基的膜蛋白蚓炬，其在N-末端顯示至少兩個跨膜螺旋。它們之間的序列同一性較低（約15–20%）躺屁。
TraG-J對
這些是與VirD4型T4CP具有相似結(jié)構(gòu)的膜蛋白肯夏，長度約為700個殘基，周質(zhì)結(jié)構(gòu)域較短。它們之間呈現(xiàn)更高的序列相似性驯击，并且像VirD4型T4CP一樣烁兰，它們可以在功能上互換。它們需要膜蛋白TraJ相互作用徊都，才可以以執(zhí)行其功能沪斟。TraJ樣蛋白的長度約為200個殘基，最多可有5個跨膜螺旋暇矫。
T4CP缺乏TMD
這個亞家族的成員沒有TMD（這個TMD對于大多數(shù)T4CP的功能是必不可少的）主之。然而，這些蛋白質(zhì)中的一些與小膜蛋白相互作用李根，形成類似于VirD4型T4CP的復合物槽奕。該亞家族中研究最多的兩種蛋白質(zhì)是TraiJPIP501（以前稱為Orf10pIP501）和TraIpIP501（以前稱為Orf9pIP501）
FtsK型T4CP
ssDNA-SpoIIIE/FtsK的轉(zhuǎn)位酶與T4CPs的結(jié)構(gòu)具有相似性。在FtsK型T4CP的情況下房轿，這種相似性增加粤攒。FtsK型T4CP具有超過750個殘基，并且?guī)讉€TMD通過大的接頭序列與NBD分開囱持。盡管它們不顯示任何AAD夯接，但它們通常具有用于ATP結(jié)合和水解的額外結(jié)構(gòu)域。
跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain):N-末端顯示跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain洪唐，TMD）
對于VirD4型T4CP钻蹬，TMD對于體內(nèi)接合是必需的。該結(jié)構(gòu)域參與T4CP和VirB10蛋白之間的相互作用凭需，這對于T4SS的激活至關(guān)重要问欠。此外，TMD對于蛋白質(zhì)寡聚化至關(guān)重要粒蜈，因為它包含此類過程的關(guān)鍵殘基顺献。TMD由α螺旋形成，并包含T4SS相互作用和T4CP功能必不可少的周質(zhì)環(huán)枯怖。
TrwBR388的TMD是最廣泛研究的注整。據(jù)報道（i）逐步消除TMD元件導致DNA轉(zhuǎn)移的頻率降低；和（ii）缺乏TMD的突變蛋白（TrwBΔN70）將導致DNA失去轉(zhuǎn)移活性度硝。
TMD可能在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有調(diào)節(jié)功能肿轨。例如：通過紅外光譜學分析研究TMD對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，觀察到TrwBR388在變性條件下（即低離子力蕊程，離液劑的存在椒袍，高溫）比TrwB N70更穩(wěn)定，因此表明TMD有助于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的更緊湊和有序折疊藻茂；TMD也對核苷酸結(jié)合活性有影響驹暑，野生型蛋白對所有核苷酸的結(jié)合親和力較低玫恳，但對嘌呤核苷酸三磷酸的特異性較高。
TMD在T4CP中顯示出多樣化的序列优俘。盡管對VirD4型T4CP的活性至關(guān)重要京办，但缺乏TMD的T4CP能夠完成其同源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。
胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (Cytosolic domain):
核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-Binding Domain 帆焕，NBD） 和全α結(jié)構(gòu)域（all-alpha domain 惭婿，AAD）
NBD是最保守的域，存在于所有的T4CP中视搏。該域具有兩個 motifs审孽；第一個基序县袱，即P環(huán)或Walker A浑娜，結(jié)合磷酸化的β和γ核苷酸。P環(huán)基序通常表示為G-x（4）-GK-（TS）式散，其中x可以是任何氨基酸筋遭，富含甘氨酸，并具有保守的賴氨酸暴拄，其后是絲氨酸或蘇氨酸漓滔。P環(huán)基序存在于許多ATP或GTP結(jié)合蛋白中，例如ATP合酶乖篷，肌球蛋白响驴，腺苷酸環(huán)化酶和ABC蛋白家族的α和β亞基。
第二個基序稱為Walker B撕蔼，其序列表示為（RK）xxxGxxx-LhhhDE豁鲤，其中x表示任何氨基酸，h表示疏水性氨基酸鲸沮。拓撲上琳骡，NBD位于膜附近，而在結(jié)構(gòu)上邑退，它是由被α螺旋包圍的扭曲的β-折疊形成的拙寡。這種構(gòu)象類似于FtsK蛋白的β結(jié)構(gòu)域举庶，F(xiàn)FtsK蛋白是一種在細胞分裂過程中驅(qū)動DNA穿過膜的膜蛋白驅(qū)動器。NBD對于T4CP的體內(nèi)活性至關(guān)重要炫狱。實際上，實際上剔猿，Walker A突變體無法完成結(jié)合视译，這可能是由于缺乏ATPase活性。缺乏ATPase活性似乎并未影響突變蛋白的其他特征艳馒，例如細胞位置憎亚，核苷酸結(jié)合親和力以及與底物的相互作用员寇。這些發(fā)現(xiàn)表明，T4CP功能可能發(fā)生在核苷酸和底物結(jié)合事件之后第美。
全α結(jié)構(gòu)域（all-alpha domain 蝶锋，AAD）
AAD面向細胞質(zhì)并呈現(xiàn)可變大小，序列和折疊模式什往。該結(jié)構(gòu)域也存在于RecA家族的許多蛋白質(zhì)中扳缕。在T4CPs中AAD會阻斷NBD，構(gòu)象改變后可能參與DNA結(jié)合别威。此外躯舔，存在于TrwBR388的AAD中的六個α-螺旋顯示出與TraMF的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似的拓撲特征，TraMF是與T4CPs相互作用的F-質(zhì)粒的松弛體的組分省古。Whitaker等（2015）報道了AAD在細菌結(jié)合中的兩個重要作用：（i）激活分泌通道粥庄；（ii）特異性識別其同源松弛體和輔助蛋白。然后豺妓，缺乏同源T4CP的移動遺傳元件必須克服這種特異性才能通過異源T4SS轉(zhuǎn)移惜互。
參考文獻：
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