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2020年2月24日，加州大學(xué)伯克利分校的Janina Tamborski 和 Ksenia V. Krasileva教授在《Annual Review of Plant Biology》發(fā)表了題為"Evolution of Plant NLRs:From Natural History to Precise Modifications"的綜述，這篇文章不僅對前人有關(guān)NLR發(fā)揮功能的潛在機(jī)制進(jìn)行了概要泪幌，還對19年植物免疫領(lǐng)域有關(guān)NLR的重要工作(ZAR1抗病小體盲厌，TIR的NAD+酶活性)進(jìn)行了點評，下面我將對該篇綜述進(jìn)行解讀祸泪。
Abstract
NLRs(Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的植物環(huán)境吗浩，尋找病原體感染的跡象。幾類NLR介導(dǎo)的免疫機(jī)制在多個物種間獨立產(chǎn)生没隘，包括NLRs功能性地分為sensors和helpers懂扼，在NLR亞家族中直接和間接識別機(jī)制的獨立出現(xiàn)，小RNAs調(diào)節(jié)NLRs和NLRs網(wǎng)絡(luò)的形成右蒲。了解NLRs的進(jìn)化歷史有助于了解病原體識別的起源和制約植物免疫系統(tǒng)的共同因素阀湿。設(shè)計抗病性的嘗試很少，而且很少得到進(jìn)化知識的支持瑰妄。這篇綜述中陷嘴，我們討論了NLR的進(jìn)化，概述以往的設(shè)計抗病性方面的嘗試间坐，并提出如何使用進(jìn)化知識灾挨，來推動未來對新出現(xiàn)的識別病原菌能力的研究邑退。
1.Introduction
1.1植物免疫感知的胞內(nèi)和胞外分支
NLRs(Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors):動植物和真菌的胞內(nèi)免疫受體。
植物免疫受體監(jiān)測細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室劳澄，尋找病原體入侵的信號地技。大量定位于細(xì)胞膜上的受體，通常被稱為病原菌識別受體(PRR)秒拔，監(jiān)視細(xì)胞外空間莫矗，尋找入侵病原體的跡象。PRR識別危險信號溯警，包括來自于MAMPS(microbe-associated molecular patterns)保守的分子模式趣苏，或DAMPS(damage-associated molecular patterns)的行為。識別危險信號后導(dǎo)致了典型的免疫響應(yīng)的激活梯轻，包括但不僅僅包括活性氧的產(chǎn)生食磕，胞內(nèi)鈣離子濃度增加，MAPK激酶的激活和防衛(wèi)基因的表達(dá)喳挑。
細(xì)胞質(zhì)的免疫受體識別外源分子彬伦，這些外源分子是由入侵的病原菌分泌到植物細(xì)胞內(nèi)的，其中一些有酶的活性伊诵，對植物成分進(jìn)行修飾单绑。之所以稱為核苷酸結(jié)合富亮氨酸重復(fù)受體(NLRs)，因為這兩個核心區(qū)域(nucleotide-binding,leucine-rich repeat)在這些蛋白質(zhì)中占多數(shù)曹宴。病原菌分泌的分子被稱為效應(yīng)子搂橙，它們的功能是通過抑制植物免疫反應(yīng)來支持病原菌的入侵。NLRs對效應(yīng)子的識別導(dǎo)致了與細(xì)胞外模式識別相同的一些反應(yīng)笛坦，包括活性氧的積累区转、MAP激酶級聯(lián)的激活和防御基因的表達(dá);然而，這些反應(yīng)的動力學(xué)不同于表面受體版扩。此外废离，NLR的激活最終導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡，稱為超敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)礁芦。
1.2NLRs是細(xì)胞內(nèi)的免疫受體
NLRs有明顯的結(jié)構(gòu)域劃分,由一個nucleotide-binding (NB-ARC)域和一系列的C端富亮氨酸重復(fù)(LRRs),和大多數(shù)包含N端的Toll/interleukin-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域,一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC),或不同的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCR)類似于抗白粉病的結(jié)構(gòu)域(RPW8)蜻韭。NLRs基于N端結(jié)構(gòu)域形成了三類:TIR-NLRs(TNLs),CC-NLRs(CNLs),RPW8-NLRs(RNLs)(F1a)∈量郏總有一些NLRs是特例肖方，例如，1.RBA1(RESPONSE TO THE BACTERIAL TYPE III EFFECTOR PROTEIN HOPBA1)只含有TIR結(jié)構(gòu)域并且能識別細(xì)菌效應(yīng)子HopBA1未状，只有TIR或RPW8的蛋白能憑借自己的力量對病原菌產(chǎn)生抗性窥妇。NLRs能直接結(jié)合并識別效應(yīng)子或效應(yīng)子發(fā)揮功能后間接識別其對植物成分的修飾。2.植物也有具有整合結(jié)構(gòu)域(IDs)的免疫受體娩践，這些結(jié)構(gòu)域模擬病原菌的靶點活翩，并在效應(yīng)子的修飾下被激活烹骨。
簡單圖注：藍(lán)字表示sensor，灰字表示helper材泄。b中沮焕，圓圈代表效應(yīng)子；被病原體靶向的植物蛋白拉宗，如圖六邊形所示峦树；效應(yīng)子的識別位點是三角形。圖a注釋有誤旦事，RPS4應(yīng)該是helper
一般情況下魁巩，我們可以將NLRs分為兩個功能組:直接/間接 sensor NLRs(涉及到入侵的識別)和helper NLRs(遺傳上一些NLRs需要helper NLRs來進(jìn)行免疫的激活)。在某些情況下姐浮，NLRs是由sensor和helper組成一對谷遂，成對地發(fā)揮功能，并且它們在遺傳上是相連的卖鲤。在一些物種中肾扰，helper NLRs被認(rèn)為從單對NLRs出現(xiàn)，然后在擴(kuò)展到許多NLRs的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)蛋逾，如NRC基因家族(NLR REQUIRED FOR CELL DEATH)集晚，在從點狀分布開始擴(kuò)展，并作為許多sensor CNLs的helper区匣。在sensor NLRs下游起作用并對抗病性和細(xì)胞死亡都起作用的RNL helpers包括ACTIVATED DISEASE RESISTANCE 1(ADR1)和N REQUIREMENT GENE1 (NRG1)偷拔。
1.3 NLR激活的機(jī)制
Effector:來源于病原菌的分子轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，改變其環(huán)境亏钩，使之有利于病原菌侵染莲绰。
NB-ARC：NLRs的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域起分子開關(guān)的作用，促進(jìn)活性受體復(fù)合物的寡聚化铸屉。
Leucine-rich repeats(LRRs):結(jié)構(gòu)域形成馬蹄形結(jié)構(gòu)钉蒲，促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用切端。
Toll/interleukin-like receptor (TIR)domain:自身或作為NLRs的一部分能誘導(dǎo)HR彻坛。
Coiled-coil (CC)helix bundle:促進(jìn)信號臺的形成;可以自發(fā)誘導(dǎo)HR。
RESISTANCE TO POWDERY MILDEW 8 (RPW8):自發(fā)發(fā)揮功能或作為NLRs的一部分踏枣，類似于真菌引起氣孔的毒素.昌屉。
TNL:N端有TIR信號結(jié)構(gòu)域的NLR。
CNL:N端有CC信號結(jié)構(gòu)域的NLR茵瀑。
RNL:N端有RPW8信號結(jié)構(gòu)域的NLR间驮。
Integrated domain(ID):整合到NLR的一類非經(jīng)典結(jié)構(gòu)域，擁有獨特的進(jìn)化歷史马昨。
Sensor:負(fù)責(zé)結(jié)合效應(yīng)子或識別效應(yīng)子活動的NLR竞帽。
Helper:被另一NLR激活或識別到效應(yīng)子后引起下游信號級聯(lián)的一類NLR扛施。
Resistosome:在受到激活時組裝成由NLRs組成的輪狀寡聚物結(jié)構(gòu)。
Guardee:一種植物蛋白屹篓，由NLR看守疙渣，監(jiān)測效應(yīng)子修改植物細(xì)胞的信號。（堆巧？妄荔？？誰檢測,NLR,還是guardee）
sensor NLRs及其helper激活的分子機(jī)制可能存在顯著差異谍肤，目前尚不完全清楚啦租。然而，它們共有的結(jié)構(gòu)域和共同的進(jìn)化起源表明荒揣，在ATP與ADP交換后通過NB-ARC結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的多聚化是NLR激活的關(guān)鍵步驟篷角。因此，NLRs常被稱為免疫信號中的分子開關(guān)乳附。結(jié)合ADP的狀態(tài)被認(rèn)為是off狀態(tài)内地，在這種狀態(tài)下LRR與NB-ARC域相關(guān)聯(lián)，從而穩(wěn)定了NLR處于非激活狀態(tài)赋除。NLRs的激活通常與ATP的結(jié)合狀態(tài)相關(guān)阱缓，稱為on狀態(tài)。
一種間接sensor蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)举农，Arabidopsis thaliana HOPZACTIVATED RESISTANCE 1(ZAR1)荆针，已經(jīng)證明了這兩種狀態(tài)，并提出存在第三種中間狀態(tài)颁糟。這些結(jié)構(gòu)表明ADP結(jié)合形式是單分子的航背，在LRR和NB-ARC之間有多個分子內(nèi)接觸點。通過LRR識別 效應(yīng)子引起的guardees改變進(jìn)而改變了NLR的蛋白構(gòu)象棱貌，從而解除了NLR的非激活狀態(tài)玖媚。ATP的加入誘導(dǎo)了一種寡聚體狀態(tài)，并形成了一種叫做抗病小體的輪狀五聚體婚脱，讓人聯(lián)想起代表Apaf-1激活狀態(tài)的哺乳動物凋亡小體和哺乳動物NLRs激活后組裝的炎癥小體今魔。ZAR1的CC端通過形成一個α螺旋管促進(jìn)了ZAR1的寡聚化≌厦常活性復(fù)合物與質(zhì)膜結(jié)合错森，漏斗內(nèi)的帶電殘基是引發(fā)細(xì)胞死亡和抗病所需的。
配體結(jié)合或修飾如何影響NB-ARC結(jié)構(gòu)域的核苷酸狀態(tài)需要進(jìn)一步闡明篮洁∩基于大量研究的觀察，一種可能性是效應(yīng)子的結(jié)合導(dǎo)致了NLR分子內(nèi)構(gòu)象的改變袁波，使NB-ARC結(jié)構(gòu)域得以暴露瓦阐，從而促進(jìn)了ADP與ATP的交換蜗侈。這也是ZAR1的情況，其中尿苷化的宿主蛋白激酶PBS1-LIKE2(PBL2)結(jié)合到ZAR1/RKS1(RESISTANCE-RELATED KINASE 1)復(fù)合物導(dǎo)致了NB-ARC相對于其他區(qū)域的旋轉(zhuǎn)睡蟋，并失去了與ADP的親和力宛篇。然而，在另一種模型中薄湿，即基于平衡的開關(guān)模型中叫倍，病原物效應(yīng)子對ADP結(jié)合狀態(tài)的NLR沒有明顯的親和力。在該模型中豺瘤，NLRs在開啟和關(guān)閉狀態(tài)之間的持續(xù)循環(huán)吆倦，病原菌效應(yīng)子穩(wěn)定了開啟狀態(tài)，使平衡向開啟狀態(tài)轉(zhuǎn)移坐求，從而導(dǎo)致防御反應(yīng)的激活蚕泽。這兩種模型可能共存，并被不同的NLRs使用桥嗤。允許不同的激活模式存在不僅可以使免疫反應(yīng)更強(qiáng)有力的抵御病原體的干擾须妻，還可以適應(yīng)效應(yīng)子不同的結(jié)合親和力。
迄今為止泛领，沒有活性TNL復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的報道;然而荒吏，合理的想法是，假設(shè)他們會基于NB-ARC結(jié)構(gòu)域的寡聚化渊鞋，從而形成一個類似的輪狀結(jié)構(gòu)绰更。TNL被認(rèn)為可以形成寡聚物，TIR結(jié)構(gòu)域可以在多個表面上自發(fā)結(jié)合锡宋。激活的ZAR1抗病小體通過其N端α螺旋與質(zhì)膜聯(lián)系,而激活的TNL復(fù)合物可能通過TIR結(jié)構(gòu)域酶解的NAD +來傳遞信號儡湾。多個植物TIRs，也包括來自哺乳動物SARM1(STERILE ALPHA AND TIR MOTIF CONTAINING 1)的TIR执俩，能夠?qū)AD+切割成NAD和cADPR(cyclic ADP-ribose);然而一些植物TIR產(chǎn)生除這兩種以外的另一種產(chǎn)物,v-cADPR徐钠。動植物中TIR的酶活性都需要自發(fā)結(jié)合，并依賴于保守谷氨酸殘基的催化活性役首。
NLRs激活后引發(fā)下游反應(yīng)尝丐，最終導(dǎo)致HR，一種局部細(xì)胞死亡的形式宋税。迄今為止摊崭，所有的TNLs都被發(fā)現(xiàn)通過信號傳遞并嚴(yán)格需要EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1)和PAD4(PHYTOALEXIN DEFICIENT 4)編碼的脂肪酶讼油，TIR結(jié)構(gòu)域的酶解產(chǎn)物如何影響下游信號元件仍然未知杰赛。最近的研究極大地加深了我們對RNLs如何在sensor NLRs下游起作用的理解。新數(shù)據(jù)表明矮台，NRG1與EDS1乏屯、SAG101(SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101)相互作用根时，形成該復(fù)合物來起始擬南芥中HR反應(yīng)。這種復(fù)合物可能直接導(dǎo)致HR辰晕，因為NRG1的RPW8結(jié)構(gòu)域讓人聯(lián)想到成孔毒素蛤迎，它可能會插入質(zhì)膜從而破壞膜的完整性。有些CNLs在遺傳上依賴NDR1(NON-RACE SPECIFIC DISEASE RESISTANCE 1),這是一種固定在質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)含友。由于ZAR1的激活狀態(tài)的抗病小體與細(xì)胞膜相關(guān)替裆，因此，NDR1可能是細(xì)胞穿孔所必需的窘问×就總的來說，這些研究使我們更近一步理解HR的啟動和功能惠赫，這是更好地理解NLR介導(dǎo)免疫的關(guān)鍵一步把鉴。
在接下來的章節(jié)中，我們將討論產(chǎn)生各種NLRs的不同進(jìn)化過程儿咱，說明系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分析如何指示NLRs的激活模式庭砍，并解釋我們?nèi)绾螌⑦@些知識應(yīng)用于設(shè)計新的抗病性中去。
2.NLR進(jìn)化的基因組學(xué)基礎(chǔ)
2.1 NLR在被子植物中的進(jìn)化
通過對100多個已測序的植物基因組的分析混埠，我們發(fā)現(xiàn)了NLR進(jìn)化的一些常見模式怠缸，而這些模式在單個物種或植物家族的研究中并不明顯。TNLs、CNLs和RNLs在其NB-ARC系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)上形成了三個單系群，并具有獨特的N端結(jié)構(gòu)域十酣，這可能說明祖先將N端不同的結(jié)構(gòu)域(TIR跪楞、CC和CCR)融合到原始的NB-ARC結(jié)構(gòu)域上(F1a)。所有這三種NLR類型都出現(xiàn)在基礎(chǔ)植物譜系A(chǔ)mborella(無油樟屬)中壹店，這表明該分支在遠(yuǎn)古時期就是拆開的。22個代表性被子植物的NLRs祖先重建結(jié)果表明，一個基底植物大約有23組NLRs嫉柴。對75個植物基因組的20571個NLRs的同源分析表明，在311個NLR家族中奉呛，只有38個NLR家族在單雙子葉植物中都是保守的计螺，而其余的家族則在不同的種系進(jìn)行擴(kuò)展。
RNLs瞧壮、TNLs和CNLs的拷貝數(shù)因植物種類而異(F1a)登馒。除了在裸子植物(在云杉中有31個ADR(一種RNL helper)同源基因)外，RNLs通常以低拷貝數(shù)為特征咆槽。RNLs表現(xiàn)出顯著的內(nèi)含子保守性陈轿，Amborella(無油樟屬)和雙子葉植物共用4個內(nèi)含子，而單子葉植物共用3個內(nèi)含子(第二個內(nèi)含子丟失了)。NRG和ADR的分離早于被子植物的分化麦射，它們在開花植物中的線性區(qū)段仍然是保守的蛾娶。NRG基因，而不是ADR基因潜秋，在一些譜系中已經(jīng)丟失蛔琅。
TNLs形成兩個亞家族，TIR1和TIR2峻呛，只有TIR2類NLRs保留在單子葉植物中罗售。TIR1 NLRs在許多雙子葉植物中保留，但在某些雙子葉植物譜系中缺失钩述。在所有開花植物中莽囤，TNLs表現(xiàn)出顯著的內(nèi)含子/外顯子連接的保守性:第一個內(nèi)含子將TIR從NB-ARC中分離出來，第二個內(nèi)含子將NB-ARC從LRRs中分離出來切距，第三個內(nèi)含子將第一個LRR基因從其余的蛋白質(zhì)中分離出來朽缎。相比之下,CNLs不共享保守的內(nèi)含子，目前的數(shù)據(jù)表明谜悟，祖先的CNLs是無內(nèi)含子的话肖，CNLs中的內(nèi)含子可能是后期進(jìn)化獲得的。
根據(jù)在大的進(jìn)化距離上保守的氨基酸基序葡幸，CNLs被細(xì)分為至少四個不同的組最筒。單雙子葉植物共有的兩組包含一個EDVID motif，如擬南芥中的ZAR1和RPM1蛋白蔚叨，馬鈴薯中的Rx蛋白和禾本科中的Sr33/MLA蛋白床蜘。一些CNLs在第一個α螺旋內(nèi)還包含一個功能性保守的N端蛋氨酸,丙氨酸,天冬氨酸,丙氨酸(MADA)motif,在寡聚化后進(jìn)行重排并且介導(dǎo)了其錨定在膜上。
在NLRs的全球進(jìn)化史的背景下(F1a)蔑水，很明顯邢锯，sensor和helper角色進(jìn)化了多次。NRC helper在1億多年前石竹目和菊科分裂之前就就已存在搀别，并在茄科中得到擴(kuò)展丹擎；而 RNL helper則更古老，可以追溯到裸子植物和被子植物分裂之前歇父。相似的是蒂培，成對的NLRs，如RRS1/RPS4(RESISTANT TO RALSTONIA SOLANACEARUM 1/RESISTANT TO PSEUDOMONAS SYRINGAE 4)和RGA4/RGA5(R-GENE ANALOG 4/R-GENE ANALOG 5)是并行進(jìn)化的的(F1a)榜苫。Sensor RPS2(RESISTANT TO PSEUDOMONAS SYRINGAE 2)和RPM1(RESISTANCE TO PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. MACULICOLA 1)保護(hù)相同的植物蛋白RIN4(RPM1-INTERACTING PROTEIN 4),但至少在單子葉植物和雙子葉植物分開之前就已經(jīng)分開了护戳，這表明它們的功能可能是獨立產(chǎn)生的。類似地垂睬，編碼可以直接結(jié)合并識別同一病原菌的基因并不在一個基因簇里面媳荒，如RPP13和RPP1(RECOGNITION OF PERONOSPORA PARASITICA)抗悍。這一發(fā)現(xiàn)證明了兩種功能相似的NLRs不一定是一并進(jìn)化來的。
2.2 特定譜系的分支擴(kuò)張及收縮
在植物基因組中肺樟，NLRs的數(shù)量有100倍的變化，從木瓜逻淌、獼猴桃么伯、黃瓜和西瓜中的幾十個到六倍體小麥中的幾千個。即使是親緣關(guān)系很近的物種也會表現(xiàn)特定譜系的擴(kuò)張和收縮卡儒。雖然驅(qū)動NLR擴(kuò)張和收縮的選擇機(jī)制仍然難以捉摸田柔，但它們可以反映植物的生活方式，并受到來自環(huán)境的選擇壓力的影響骨望。與NLR歷史相關(guān)的植物生活方式包括水生環(huán)境和雌雄異株(獼猴桃硬爆，木瓜)或有單獨的雄花和雌花(玉米，黃瓜)擎鸠。NLR庫的群體遺傳學(xué)研究表明缀磕，環(huán)境壓力影響了單個物種內(nèi)NLR的多樣性，例如野生番茄和擬南芥對病原菌的適應(yīng)劣光，并可能導(dǎo)致多態(tài)性的長期維持袜蚕。
如何在較短的進(jìn)化時間內(nèi)實現(xiàn)NLRs的擴(kuò)展或收縮？茄科和禾本科的CNL爆發(fā)性增長绢涡，部分原因是長末端重復(fù)(LTR)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活動牲剃。NLRs本身的重復(fù)特性也有助于它們的進(jìn)化，利用重組進(jìn)行基因轉(zhuǎn)換和利用復(fù)制機(jī)制進(jìn)行局部復(fù)制雄可。
2.3 NLR等位基因的多樣性和新基因融合
即使在親緣關(guān)系較近的物種中也能觀察到NLR基因的擴(kuò)張和收縮;然而凿傅，單靠基因復(fù)制不足以產(chǎn)生新的病原菌識別。在所謂的生與死模型中提出的NLR快速進(jìn)化在今天仍然適用数苫。目前的基因組數(shù)據(jù)集支持通過基因內(nèi)和基因間重組和基因轉(zhuǎn)換產(chǎn)生嵌合LRRs聪舒、以及LRRs表面暴露區(qū)域的點突變，來支持NLRs的多樣化虐急。這種NLRs能夠識別高度可變甚至結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的效應(yīng)子过椎，很可能是通過直接結(jié)合機(jī)制實現(xiàn)的，并且能夠產(chǎn)生抵抗多種病原菌的抗性戏仓。具有等位基因變異頻率高的NLRs可以出現(xiàn)在TNL或CNL分支中疚宇，這一類NLRs并不是單系的。
最近赏殃，帶IDs(Intergrated domain)的NLR展現(xiàn)了新的識別特性敷待。禾本科的一個特殊的NLR-ID分枝， MIC1(major integration clade 1)仁热，持續(xù)變換IDs的位置榜揖，從而促進(jìn)新ID sensor的產(chǎn)生勾哩。NLR-IDs顯示了復(fù)制和染色體內(nèi)易位的證據(jù)，但確切的結(jié)構(gòu)域整合進(jìn)基因組的機(jī)制目前仍不清楚举哟。對小麥NLR-ID的分析表明思劳，一旦ID整合到基因組的NLR附近，選擇性剪接就會產(chǎn)生融合的轉(zhuǎn)錄本妨猩。
快速產(chǎn)生新的識別特異性的代價是:自身免疫潜叛。在擬南芥中，幾個NLRs的等位基因變異與自身免疫有關(guān)壶硅，這表明NLRs與其守衛(wèi)(guardees)可能不匹配威兜。擬南芥NLR RPP7的等位基因變異最近被證明，當(dāng)與RPW8的不兼容等位基因結(jié)合時會引起自身免疫反應(yīng)庐椒。人們可能會推測椒舵，高度自交系作物(如玉米)基因組中低數(shù)量的NLRs是由自身免疫造成的，因為自身免疫會導(dǎo)致不匹配NLRs丟失约谈”仕蓿【這一部分我的理解是玉米轉(zhuǎn)座子多，也就容易產(chǎn)生NLR的變體棱诱，進(jìn)而產(chǎn)生自身免疫措伐，進(jìn)化中導(dǎo)致了這類NLR丟失，進(jìn)而基因組中NLR的數(shù)量低】
2.4 sensor和helper NLRs中的功能網(wǎng)絡(luò)
Flor最初的有關(guān)R基因與效應(yīng)子識別中的“基因?qū)颉奔僬f進(jìn)化為包括sensors和helpers功能性網(wǎng)絡(luò)的新的范例军俊。RPS2和RPM1是sensor NLRs的經(jīng)典例子侥加，它們可以通過保護(hù)效應(yīng)子靶點的中心蛋白RIN4來追蹤多個效應(yīng)子。其他NLRs如ZAR1監(jiān)測多個旁系同源的guardees粪躬，每個旁系同源的guardee跟蹤一個不同的效應(yīng)子担败。帶有完整的WRKY結(jié)構(gòu)域編碼NLR-ID的RRS1的等位基因可以檢測到至少兩個效應(yīng)子，AvrRps4和PopP2 镰官，并且RRS1/RPS4這對組合可以抵抗三種不同的病原菌提前。雖然一個NLR可以識別多個效應(yīng)子，但獨立進(jìn)化的NLRs也可以識別同一效應(yīng)子泳唠。在大豆和擬南芥中狈网，RIN4分別受到進(jìn)化上不相關(guān)的NLRs Rpg1b/Rpg1r和RPM1/RPS2的保護(hù)，這表明對假單胞菌效應(yīng)子AvrRpm1和AvrB的識別是獨立進(jìn)化的笨腥。另一種假單胞菌效應(yīng)子拓哺，有蛋白酶活性的AvrPphB，對它的識別在擬南芥和大麥中至少進(jìn)化了兩次脖母，通過NLRs保護(hù)同一靶點士鸥，PBS1(AVRPPHB SUSCEPTIBLE 1)。最后谆级，直系同源NLRs烤礁，如MLA/Sr33/Sr50和Rx1/Gpa2讼积，通過等位基因變異進(jìn)化出對不同效應(yīng)子的識別〗抛校總之勤众，這些研究表明，sensor NLR的識別特異性不能僅僅基于一級序列的相同來確定鲤脏。
Helper NLRs可以形成自己的功能網(wǎng)絡(luò)们颜。在擬南芥中，TNLs和CNLs可以通過NRG1和ADR1亞支的蛋白進(jìn)行信號傳遞凑兰，其中TNLs對NRGs表現(xiàn)出更強(qiáng)的偏好掌桩，而CNLs對ADRs表現(xiàn)出更強(qiáng)的偏好边锁。NRC helper 分枝代表了一個更新的網(wǎng)絡(luò)姑食，也支持一個緊密相關(guān)的CNL sensor 分枝。雖然配對的NLR基因(如RGA4/RGA5和RRS1/RPS4)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物也顯示出物理相互作用茅坛，但迄今為止音半，NLRs對NRC和RNL的功能依賴僅在遺傳學(xué)上表現(xiàn)出來。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是否是成對的NLRs所特有的贡蓖，是否在helper網(wǎng)絡(luò)的形成過程中已經(jīng)丟失曹鸠，這仍有待確定。
NLR生物學(xué)中趨同進(jìn)化的模式
3.1在NLR進(jìn)化過程中斥铺，sensors對helpers的依賴不止一次出現(xiàn)
在在單雙子葉植物中彻桃，RNL分支是一個古老而保守的helper群，而NRCs的helper的功能是獨立產(chǎn)生的(F2a)晾蜘。NRC很可能是在1億多年前從一對茄科的NLR演化而來邻眷，并從那以后演化成一個由helper和sensor組成的功能性網(wǎng)絡(luò)。
甚至最近剔交，兩個獨立的分支TNLs和CNLs肆饶，在禾本科和十字花科中被細(xì)分為sensors和helpers，以RRS1/RPS4和RGA5/RGA4為代表(F2a)岖常。有趣的是驯镊，禾本科和十字花科編碼sensor和helper配對的基因在基因上是頭對頭定向連接的，sensor通常帶有一個ID(圖2aii竭鞍，此處原文注釋也有問題)板惑。基因組和進(jìn)化機(jī)制（如偎快，驅(qū)動基因?qū)︻^對頭的方向的聚合洒放，融合IDs，或功能細(xì)分成helpers和sensors）目前還不知道滨砍。
sensor免疫受體對附加受體的依賴并不是植物獨有的往湿。在動物NLR家族中妖异，NAIP5(APOPTOSIS INHIBITORY PROTEIN 5)是一種結(jié)合鞭毛蛋白的sensor，并且它依賴于helper NLR 家族NLRC4 (CASPASE ACTIVATION AND RECRUITMENTDOMAIN- CONTAINING 4)來執(zhí)行響應(yīng)领追。即使在NLR家族之外他膳，像 FLS2(FLAGELLIN SENSING 2)和BRI1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1)這樣的結(jié)合配體的受體激酶在功能上作為一種sensor，依賴于與共受體BAK1(BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1)的物理相互作用來進(jìn)行復(fù)雜的激活和下游信號傳導(dǎo)绒窑。因此棕孙，配體感應(yīng)受體需要一個額外的伴侶是一個普遍的進(jìn)化主題。重要的是要了解這樣的要求是否是受體啟動信號級聯(lián)的共同功能約束強(qiáng)加的些膨，還是由于額外的調(diào)節(jié)水平導(dǎo)致的(受體共受體協(xié)同發(fā)揮作用)【這句話翻譯的繞口的很蟀俊，請忽略】。
3.2 小RNA對NLRs的調(diào)節(jié)
對NLRs的不當(dāng)調(diào)節(jié)代價高昂;因此订雾，NLRs在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都受到嚴(yán)格的調(diào)控肢预。對植物基因組中的NLRs進(jìn)行的整體分析揭示了一個共同的模式：NLRs能夠被miRNAs調(diào)節(jié)，并且miRNAs能夠從重復(fù)的NLRs產(chǎn)生(F2b)洼哎。一些miRNAs烫映，如靶向CNLs的miR482/2118，很早以前就出現(xiàn)了;這些miRNA家族在大多數(shù)植物譜系中都是保守的噩峦，并且靶向NB-ARC區(qū)域保守P-loop區(qū)域锭沟。其他的miRNAs是最近出現(xiàn)的，并且具有譜系特異性的识补。新的miRNAs的持續(xù)進(jìn)化與NLRs譜系特異性的擴(kuò)增有關(guān)族淮，新的miRNAs可能來自于目標(biāo)NLR序列的倒置復(fù)制。
miRNAs對NLRs的調(diào)控與小rna (sRNAs)對快速增殖的遺傳元件(轉(zhuǎn)座子(TEs))調(diào)控相似凭涂。NLRs和TEs都能快速復(fù)制祝辣，表現(xiàn)出譜系特異性的擴(kuò)張和收縮，并能在基因組中跳躍导盅。無論是新插入的TEs较幌，還是最近復(fù)制的基因，都受到由sRNAs介導(dǎo)的RNA依賴的DNA甲基化(RdDM)來調(diào)控的表觀遺傳標(biāo)記白翻。在丁香假單胞菌侵染中乍炉，對sRNAs和擬南芥表觀遺傳標(biāo)記的改變的整體分析發(fā)現(xiàn)，無論是TEs還是NLRs均在感染早期被釋放滤馍，并開始產(chǎn)生sRNAs岛琼，這些sRNAs中有許多映射到NLR和TE位點。雖然在侵染過程的后期巢株，通過RNA介導(dǎo)向的DNA甲基化(RdDM)在基因組位點沉積新的DNA甲基化可以使TEs沉默槐瑞，但是許多NLRs可以繼續(xù)表達(dá)，盡管靶向它們的sRNAs仍然存在阁苞，如ADR1困檩。
在啟動子元件中插入TEs對NLRs的協(xié)同調(diào)節(jié)具有重要的功能作用(圖2b)祠挫。在水稻中，在NLR基因pigmS的啟動子中插入一個微型的反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件悼沿，可以限制其在花粉的表達(dá)等舔，并通過RdDM沉默pigmS在其他植物組織中的轉(zhuǎn)錄。從功能上講糟趾，PigmS蛋白是另一種NLR (PigmR)的顯性抑制因子慌植，pigmR對稻瘟菌具有抗性。當(dāng)PigmS沉默時义郑，PigmR蛋白是活躍的蝶柿，并在營養(yǎng)器官中提供抗性;然而，在花粉中非驮，它被PigmS所抑制交汤，因此減少了在水稻籽粒中激活免疫信號造成的產(chǎn)量損失。更好地理解sRNAs對NLR的調(diào)控和可逆的表觀遺傳標(biāo)記院尔，可以為設(shè)計平衡免疫激活和產(chǎn)量損失的NLR啟動子提供新的策略蜻展。
3.3 與哺乳動物內(nèi)在免疫的相似性
普遍的NLR特征的獨立進(jìn)化不僅在植物譜系中是明顯的喉誊，而且在生物界中也是明顯的邀摆。在動物中，一個關(guān)系遙遠(yuǎn)的NB-ARC結(jié)構(gòu)域的同系物伍茄，NACHT栋盹，獨立地與LRRs和不同的信號結(jié)構(gòu)域[CARD(CASPASE ACTIVATION AND RECUITMENT DOMAIN),BIR(BACILLOVIRUS INHIBITOR OF APOPTOSIS PROTEIN REPEAT),PYD(PROTEIN PYRIN DOMAIN),DD(DEATH DOMAIN),DED(DEATH EFFECTOR DOMAIN)]結(jié)合。哺乳動物NLRs具有類似的細(xì)胞內(nèi)監(jiān)視功能敷矫，可在感知到病原體或自身免疫發(fā)生時會誘導(dǎo)細(xì)胞死亡例获。在真菌中，含有NACHT域的蛋白質(zhì)Het-E觸發(fā)非自我識別并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡曹仗，稱為異核體不親和性榨汤。有趣的是，真菌HeLo結(jié)構(gòu)域具有與RNLs中RPW8類似的四螺旋束折疊結(jié)構(gòu)怎茫，可以將自己插入膜中收壕，從而形成一個孔洞，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡轨蛤。
最近在植物NLRs結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的一個突破是解決了ZAR1及其守衛(wèi)RKS1和PBL2激酶活性寡聚復(fù)合體的結(jié)構(gòu)蜜宪。ZAR1抗病小體在結(jié)構(gòu)上類似于Apaf-1的凋亡小體和哺乳動物NLRs的炎癥小體(F2c)。雖然炎癥小體和抗病小體之間的結(jié)構(gòu)相似性很明顯祥山，但仍有許多問題沒有得到解答圃验。
首先，CNLs的CC結(jié)構(gòu)域是否足以在細(xì)胞膜上形成一個孔并導(dǎo)致細(xì)胞死亡缝呕，還是需要額外的因素澳窑？RNLs和它們的RPW8結(jié)構(gòu)域斧散，足以在膜上形成一個孔，這與真菌HeLo蛋白結(jié)構(gòu)相似摊聋，是顯而易見的(誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的)候選者颅湘。
第二，是否所有的sensor都形成均勻的抗病小體栗精，或者抗病小體的組成是否變化闯参？例如，是等比例配對的helper和sensor悲立，還是單個sensor啟動多個helper的復(fù)合物形成(F2c)鹿寨？后者是哺乳動物的情況，比如NAIP5和NLRC4薪夕。單個NAIP5 sensor被鞭毛蛋白感知激活脚草，在構(gòu)象改變后，與它的helper NLRC4結(jié)合原献，進(jìn)一步誘導(dǎo)NLRC4-NLRC4寡聚物形成馏慨。最后的炎癥小體形成一個開放環(huán)結(jié)構(gòu)，具有1個NAIP5 sensor和9個NLRC4 helper姑隅。雖然ZAR1抗病小體是均質(zhì)的【這里我的理解是自身形成五聚體写隶，而不與其他蛋白共同形成，如helper】讲仰，但我們不能排除其他植物NLRs形成類似NAIP5/NLRC4的異質(zhì)蛋白復(fù)合物的可能性慕趴。CCs可以形成由復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)組成的同質(zhì)和異質(zhì)寡聚物，這支持了異質(zhì)抗病小體的概念(F2c)鄙陡。雖然CNLs通常形成異質(zhì)寡聚體冕房，但TNL異寡聚體的報道相對較少，目前僅限于成對的NLRs趁矾。這將是令人興奮的耙册，看看配對的NLR抗病小體的組成是否新穎，是否有等比例的sensor和helper(F3c)毫捣。
植物和哺乳動物執(zhí)行細(xì)胞死亡的相似性超越了抗病小體到炎癥小體的結(jié)構(gòu)相似性详拙。最近關(guān)于細(xì)菌、哺乳動物和植物TIR結(jié)構(gòu)域NADase活性的報道揭示了細(xì)胞死亡的激活可以通過保守的第二信使介導(dǎo)培漏。結(jié)構(gòu)分析顯示溪厘，哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞死亡的執(zhí)行蛋白SARM1和植物TIRs的TIR結(jié)構(gòu)域存在保守的底物結(jié)合位點。與跨界TIR蛋白的共同功能相一致牌柄，在本生煙中表達(dá)SARM1的TIR結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了在視覺上與HR難以區(qū)分的細(xì)胞死亡反應(yīng)畸悬。SARM1和TNLs主要的區(qū)別是它們的遺傳需求不同。與植物TIRs不同的是，SARM1能夠獨立于EDS1和NRG1誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡蹋宦。對最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡反應(yīng)的精確信號級聯(lián)的闡明可以進(jìn)一步揭示不同物種間的相似性披粟，并闡明EDS1和NRG1的植物特異性作用。
最后冷冗，所得到的抗病小體結(jié)構(gòu)是否代表了其功能活性狀態(tài)守屉？對哺乳動物NLRs的研究表明，炎癥小體形成后蒿辙，激活的caspase結(jié)構(gòu)域可能被蛋白酶介導(dǎo)釋放拇泛。因為它已被廣泛證明在植物N端截短的NLRs，如TIRs或CCs足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,有可能活性的抗病小體在植物細(xì)胞中進(jìn)一步被修改思灌，進(jìn)而誘發(fā)HR反應(yīng)俺叭。
我們能從觀察到的常見NLR進(jìn)化模式中學(xué)到什么？其中一個主要的實際結(jié)果是泰偿，有多種方式進(jìn)化為相同的功能熄守，新功能也可以以多種方式設(shè)計。這些功能的設(shè)計可以通過學(xué)習(xí)NLR生物學(xué)的一般原理來指導(dǎo)耗跛。
4.基因工程改造NLR等位基因當(dāng)前的進(jìn)展
4.1 NLR嵌合體定義了效應(yīng)子結(jié)合區(qū)域裕照，并允許在等位基因NLRs之間進(jìn)行識別轉(zhuǎn)移
亞麻NLRs嵌合體是首次改變NLRs識別效應(yīng)子的一次成功嘗試。本研究分析了亞麻抗銹病基因L (L, L1-L11, LH)的13個等位基因调塌，以確定變異區(qū)域晋南。他們隨后創(chuàng)造了L2、L6和L10的嵌合體;然后轉(zhuǎn)入亞麻;并對亞麻銹病易感性的變化進(jìn)行了篩選烟阐。NLRs之間交換的區(qū)域包含880個氨基酸搬俊，包括整個LRR區(qū)域紊扬。表達(dá)這些嵌合體的轉(zhuǎn)基因亞麻植株表現(xiàn)出與LRR相關(guān)的抗性和易感性表型;也就是說蜒茄，含有L6- TIR-NBARC和L2 - LRR的嵌合基因L6-L2表現(xiàn)出了L2等位基因的抗病表型。這一發(fā)現(xiàn)表明餐屎，LRR區(qū)域可以充分調(diào)節(jié)NLRs的識別特異性檀葛，直接與它們所識別的效應(yīng)子相互作用。自從第一次在L中進(jìn)行LRR交換以來腹缩，其他幾個直接結(jié)合物【我覺得這里是NLR直接識別effector】中的識別特異性由LRR區(qū)域決定屿聋。這已經(jīng)通過等位基因交換或在體內(nèi)的相互作用得到證明。
4.2在植物蛋白中引入新的效應(yīng)子底物序列
NLRs可以直接與效應(yīng)子結(jié)合或通過監(jiān)測宿主蛋白(i.e.a guardee)來識別效應(yīng)子(圖1b)藏鹊。由于我們對效應(yīng)子功能的理解在不斷提高润讥，利用效應(yīng)子活動來設(shè)計抗性似乎是一個很好的解決方案。Kim使用這一策略來設(shè)計RPS5的guardee盘寡，使得RPS5能識別更多的效應(yīng)子楚殿。RPS5識別細(xì)菌效應(yīng)子AvrPphB的活動，AvrPphB作為蛋白酶作用于PBS1和相關(guān)的受體類胞質(zhì)激酶(RLCKs)竿痰。當(dāng)AvrPphB破壞植物中這類蛋白后脆粥，這些RLCKs發(fā)生構(gòu)象變化砌溺，這種構(gòu)象變化被RPS5識別并導(dǎo)致免疫反應(yīng)的激活。在感病型的擬南芥中將PBS1的蛋白水解位點換成另一效應(yīng)子AvrRpt2的蛋白水解位點变隔，極大地提高了其對丁香假單胞菌的抗性规伐。同樣的策略也被用于將煙草腐蝕病毒的病毒蛋白酶NIa的蛋白水解位點插入到PBS1中。盡管這種方法在本氏煙中導(dǎo)致了NIa切割PBS1和HR反應(yīng)匣缘，但這種操作只增強(qiáng)了煙草對病毒的部分抗病性猖闪。這一發(fā)現(xiàn)表明，底物切割率和信號強(qiáng)度需要足夠強(qiáng)才能引起強(qiáng)有力的響應(yīng)肌厨，并可能對不同的效應(yīng)子有不同的要求萧朝。因此，在某些情況下夏哭，這種方法可能需要額外的優(yōu)化和蛋白質(zhì)工程來產(chǎn)生抗病性检柬。
4.3引入氨基酸變化來修改效應(yīng)子識別特異性
LRR可作為效應(yīng)子結(jié)合位點和介導(dǎo)NLR識別特異性促使許多人嘗試產(chǎn)生隨機(jī)突變的LRRs以產(chǎn)生新的抗病性。NLR Rx能夠?qū)ζ渫鈿さ鞍讱埢鵗(ser)121和K(lys)127 (CP- TK)發(fā)生變化的突變體馬鈴薯病毒x產(chǎn)生抗性竖配。在這兩個位置分別帶有賴氨酸和精氨酸的CPs(CP-KR)不能被Rx識別【上面這段話也就說明Rx不能識別CP-TK和CP-KR】何址。在一項研究中，利用容易出錯的PCR进胯，對Rx進(jìn)行隨機(jī)突變用爪，篩選出數(shù)千個突變體，期望得到識別CP-KR的突變體胁镐。這種方法產(chǎn)生了幾個Rx突變體蛋白偎血，該Rx突變體蛋白對攜帶CP-KR和CP-TK的馬鈴薯病毒x，以及另一種相關(guān)病毒——楊樹花葉病毒盯漂，展示出抗性颇玷。雖然這種方法擴(kuò)大了對Rx的認(rèn)識，但并沒有產(chǎn)生新的抗病性【這里新的抗病性沒有產(chǎn)生我的理解是還是抗同一病原菌就缆，不過是擴(kuò)大了小種范圍】帖渠。
2014年發(fā)表的兩項研究通過隨機(jī)誘變、基因轉(zhuǎn)移和定點誘變等手段竭宰，擴(kuò)大了野生馬鈴薯(Solanum demissum) NLR R3a的識別能力空郊。野生型R3a可以識別Phytophthora infestans的效應(yīng)子Avr3aKI，而不是等位基因變體Avr3aEM切揭，它(Avr3aEM)已經(jīng)成為現(xiàn)代Phytophthora(病)中流行的等位基因狞甚，很可能是由于Avr3aEM逃避了R3a介導(dǎo)的抗性后通過正向選擇被保留了下來。Segretin等人鑒定了八種R3a單氨基酸替換突變體廓旬，在響應(yīng)AvrR3aEM時哼审，它們能夠觸發(fā)本氏煙中的HR反應(yīng)。其中6個突變位于LRR區(qū)域，1個位于NB-ARC, 1個位于CC棺蛛。Chapman等人在經(jīng)過幾輪人工進(jìn)化后怔蚌，發(fā)現(xiàn)了幾個與WT相比，對細(xì)胞死亡反應(yīng)更強(qiáng)烈突變體旁赊。然而桦踊，這些被改造的NLRs，被稱為R3a+和R3a*终畅，對攜帶Avr3aEM的P. infestans菌株并沒有增強(qiáng)的抗性籍胯。
在一項后續(xù)研究中，Segretin和同事將發(fā)現(xiàn)的突變轉(zhuǎn)移到R3a在番茄的同源基因I2中离福，看看獲得的功能突變是否可以在同源基因之間轉(zhuǎn)移杖狼。I2通過識別Avr2，對番茄鐮刀菌產(chǎn)生抗性妖爷，I2與R3a序列相似度高蝶涩。R3a+等位基因中的兩個殘基(I141F和N336Y)在I2中保守，在I2中進(jìn)行突變以便于查看其識別能力是否會擴(kuò)大絮识。然而绿聘，I2中發(fā)生這些氨基酸改變會導(dǎo)致識別能力的喪失或自發(fā)活動。假設(shè)同源NLRs中的這兩個位點可能是NLR敏感化的關(guān)鍵次舌，為了驗證這個假設(shè)熄攘，Giannakopoulou將兩個殘基突變?yōu)樗锌赡艿钠渌被帷ｈb定到了I2I141N彼念，它可以識別Avr3aKI和Avr3aEM挪圾，以及兩個新的Avr2變種。在本氏煙中表達(dá)這些NLRs導(dǎo)致了其對攜帶任一Avr3a變種的P. infestans的部分抗性逐沙。因此哲思，迄今為止，試圖隨機(jī)誘變NLRs并沒有導(dǎo)致新的抗病能力的產(chǎn)生酱吝。
5.工程改造NLRs的前景和挑戰(zhàn)
5.1設(shè)計在面對效應(yīng)子活動時激活NLR的guardees
利用效應(yīng)子的活性來設(shè)計新的抗病性是一種很有前途的策略也殖，因為病原菌效應(yīng)子往往在進(jìn)化過程中避開NLR的結(jié)合，同時保持其活性务热。有幾種方法可以利用效應(yīng)子的活性來避開病原體的危害。這包括Kim等人采用的策略己儒，將已知的效應(yīng)子靶向的蛋白水解位點轉(zhuǎn)移到由植物NLR保護(hù)的植物蛋白上崎岂。我們也許可以這樣設(shè)計一個guardee，它經(jīng)過幾個效應(yīng)子的修飾后可以激活NLR(圖3a)闪湾。單一防衛(wèi)的NLR可以識別多少種不同類型的效應(yīng)子活動呢冲甘？RIN4被幾種NLRs(包括RPS2和RPM1)保護(hù)，并被幾種具有不同酶活性的效應(yīng)子靶向，這表明NLRs的間接識別實際上只能識別一種修飾江醇，因為RPM1只有在RIN4被磷酸化后才被激活濒憋，而RPS2可以識別RIN4的溶蛋白性裂解。RIN4被幾個NLRs保護(hù)陶夜，這一事實使得它成為引入更多效應(yīng)子靶點的有吸引力的候選凛驮。效應(yīng)子酶活性的研究將繼續(xù)擴(kuò)大這一方法的潛在靶點。通過選擇對病原體入侵至關(guān)重要的效應(yīng)子条辟，我們可以嘗試創(chuàng)造持久的抗性黔夭。這種方法需要對效應(yīng)子活動有全面的了解。因此羽嫡，理解天然效應(yīng)子的靶點及其活動對這種改造方法至關(guān)重要本姥，并將極大地提高我們對創(chuàng)造新的識別能力的認(rèn)識。
5.2 改造NLRs杭棵，使其帶有新的整合結(jié)構(gòu)域(Integrated Domains)
除了修改guardees之外婚惫，我們還可以使用IDs來設(shè)計NLR分支。理想情況下魂爪，我們可以使用現(xiàn)有的NLR-IDs作為平臺辰妙，利用效應(yīng)子相互作用研究中確定的目標(biāo)來創(chuàng)建融合(圖3b)。實際上甫窟，我們今天所觀察到的NLR-IDs具有自最初的融合事件以來已經(jīng)共同進(jìn)化了數(shù)百萬年的結(jié)構(gòu)域密浑。因此，這種工程方法將需要仔細(xì)解剖共進(jìn)化區(qū)域或鑒定多面手的NLR粗井，這種NLR仍然可以接受新的可變結(jié)構(gòu)域融合尔破，如在禾本科鑒定的來自MIC1的NLRs。它還需要更好地理解NLR-ID激活機(jī)制浇衬。如懒构，效應(yīng)子對ID的修改如何改變NLR-ID的構(gòu)象?helper NLR在這一對組合(NLR和effector)中的角色是什么？針對不同的NLR配對情況提出了對比模型;一種觀點認(rèn)為helper抑制了sensor NLR的自發(fā)活動耘擂，而另一種觀點認(rèn)為helper介導(dǎo)了免疫信號的啟動胆剧。提高我們對成對NLRs的認(rèn)識將促進(jìn)對新NLR-ID融合蛋白免疫激活響應(yīng)的精細(xì)調(diào)節(jié)。
在水稻Pik基因的等位基因序列中醉冤，整合的 HMA結(jié)構(gòu)域(heavy-metal-associated)是NLR中最具多態(tài)性的區(qū)域秩霍，強(qiáng)烈提示它是效應(yīng)子的結(jié)合界面。Pik等位基因及其相應(yīng)的效應(yīng)子的晶體結(jié)構(gòu)證實了這一觀點蚁阳。使用效應(yīng)子結(jié)合到ID的一個合理的下一步是交換效應(yīng)子靶向的其他已知宿主結(jié)構(gòu)域的IDs(圖3b)铃绒。這樣的交換將使效應(yīng)子的識別成為可能，效應(yīng)子的功能仍然難以實現(xiàn)螺捐，但是通過將效應(yīng)子引入到現(xiàn)有的NLR-ID支架中颠悬，效應(yīng)子的靶點已經(jīng)被鑒定(圖3b)矮燎。除了創(chuàng)造新的融合蛋白外，現(xiàn)有的IDs蛋白工程可以改變NLR和效應(yīng)子之間的結(jié)合強(qiáng)度赔癌，從而提高現(xiàn)有的識別能力诞外。為此，從與幾個等位效應(yīng)相關(guān)的NLRs晶體結(jié)構(gòu)中獲得知識灾票，如康塞普西翁所做的那樣峡谊，提高了我們對結(jié)合界面的理解，以及需要改變哪些氨基酸來增加結(jié)合親和力铝条。這些信息將有助于指導(dǎo)設(shè)計工作靖苇，以超越過去使用的隨機(jī)誘變方法。
5.3 利用具有自然多樣性的LRR結(jié)合特異性的NLRs
效應(yīng)子與NLR相互作用的最簡單模式是通過可變的LRR區(qū)域直接結(jié)合班缰，因為它涉及的遺傳成分最少贤壁。因此，(設(shè)計效應(yīng)子)直接結(jié)合的NLRs可能是最容易設(shè)計的NLRs類型(圖3c)埠忘。然而脾拆，我們目前缺乏這些相互作用的結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)。關(guān)鍵的未解決的問題包括決定結(jié)合特異性的LRR殘基是哪些莹妒、產(chǎn)生相互作用所需的典型親和力是哪些以及引發(fā)免疫信號激活的結(jié)構(gòu)重排是什么名船。為了克服這一局限性，我們可以在前面討論過的亞麻L基因等位基因序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究旨怠，并通過自然等位基因多樣性和結(jié)構(gòu)建模來一致地鑒定LRRs中的結(jié)合部位渠驼。通過對NLRs種內(nèi)自然多樣性的采樣，我們旨在查明在一個LRR中的10-20個殘基鉴腻，這些殘基是最易變的迷扇，因此很可能參與效應(yīng)子的結(jié)合。這類殘基集將允許有針對性的工程改造爽哎，要么改進(jìn)現(xiàn)有的結(jié)合特異性蜓席，要么推出新的結(jié)合特性。
6. 結(jié)論和未來方向
了解NLRs的進(jìn)化對于確定其功能课锌、了解環(huán)境壓力對植物免疫受體庫的影響以及設(shè)計新的識別特異性至關(guān)重要〕冢現(xiàn)在很清楚的是，我們不能將對一種NLR的認(rèn)識應(yīng)用于另一種NLR渺贤。然而雏胃，NLRs的系統(tǒng)發(fā)育位置可能表明它們是更有可能成為helper(如RNLs)還是sensor，以及它們依賴于哪種helper(如sensor 的NRC-dependent 分支) 癣亚。此外丑掺，IDs不僅突出了可能被病原體靶向的植物蛋白，從而受到植物免疫系統(tǒng)的監(jiān)測述雾，而且還為效應(yīng)子導(dǎo)向的工程方法提供了前所未有的潛力街州。然而，重要的是要記住玻孟，即使在一個分支的基因之間也可能存在功能差異唆缴，就像十字花科和茄科的NRG1表現(xiàn)一樣。隨著序列數(shù)據(jù)庫的發(fā)展黍翎，我們將能夠提出關(guān)于NLR進(jìn)化的越來越有挑戰(zhàn)性的問題面徽，并找到以前被噪聲掩蓋的常規(guī)模式【這里的噪聲我覺得是技術(shù)受限】。
NLRs的改造已經(jīng)證明是困難的匣掸，成功的報告仍然是有限的趟紊。根據(jù)我們目前對NLRs的了解，有三種主要的策略來創(chuàng)建新的抗病性碰酝。新近獲得的群體內(nèi)NLRs序列多樣性為預(yù)測效應(yīng)子結(jié)合的表面提供了原材料霎匈。對于NLR-IDs，很明顯送爸，IDs有可能成為效應(yīng)子靶向的目標(biāo)平臺铛嘱。我們現(xiàn)在需要了解融合的時間以及隨后與經(jīng)典的NLR結(jié)構(gòu)域的共同進(jìn)化。此信息將通知選擇可用于交換ID的支架NLR袭厂。例如墨吓，來自進(jìn)化最年輕的分支MIC1的NLR-IDs可能擁有被成功改造的最大潛力。在不久的將來纹磺，從NLR進(jìn)化中得到的經(jīng)驗教訓(xùn)及合成帖烘、結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)步中獲得的將使我們能夠創(chuàng)造出令人垂涎的NLRs。
總結(jié)要點
1.核苷酸結(jié)合富亮氨酸重復(fù)受體(NLRs)在sensor和helper中的亞功能化在不同物種中多次獨立出現(xiàn)橄杨。
2.從NLR對進(jìn)化而來的helper比CC-NLR (RNL)的helper在進(jìn)化上要早秘症。？讥珍？历极？
3.NLRs中sensor和helper信號元件的亞功能化與模式識別受體的受體和共受體的關(guān)系有關(guān)，這可能是一個普遍的進(jìn)化主題衷佃。
4.雖然僅從序列上預(yù)測NLRs的作用模式是具有挑戰(zhàn)性的趟卸，但在演化支中的系統(tǒng)發(fā)育位置可以幫助預(yù)測NLRs的遺傳需求。
5.NLRs的設(shè)計一直很困難氏义，到目前為止只取得了有限的成功锄列。
6.理解NLRs的進(jìn)化可以為設(shè)計工作提供信息，并指導(dǎo)設(shè)計人員設(shè)計具有新的識別特異性的NLRs。
未來的問題
1.為什么植物會失去某些NLR支系而擴(kuò)展其他支系震桶？
2.種內(nèi)和種間的進(jìn)化模式是否守恒济榨。
3.人類和病原體的進(jìn)化壓力如何影響免疫基因的進(jìn)化?這在不同的系統(tǒng)之間，包括在馴化系統(tǒng)和野生系統(tǒng)之間是一致的嗎筒严？
4.NLRs的調(diào)節(jié)是通過什么樣的時間尺度和什么方式來進(jìn)行丹泉？并且這種調(diào)節(jié)能隨著環(huán)境的變化而變化以適應(yīng)不同的生長損失?與NLR內(nèi)的序列進(jìn)化相比，這是以更快還是更慢的速度發(fā)生的?
5.為什么NLRs會細(xì)分為helpers和sensors?這個關(guān)系是如何工作的鸭蛙，這個復(fù)合物是如何被效應(yīng)子激活的呢摹恨？
6.在EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1)，PAD4(PHYTOALEXIN DEFICIENT 4)和RNL helpers這三者中有什么功能性聯(lián)系娶视？導(dǎo)致超敏反應(yīng)(HR)的確切分子事件是什么?它在植物免疫中的作用是什么?
7.整合結(jié)構(gòu)域(IDs)的功能是什么?例如晒哄，它們僅僅是病原體的誘餌，還是它們通過將NLR定位到正確的亞細(xì)胞區(qū)室來完成某種功能?
8.哪些NLR-IDs可以作為新的融合蛋白的平臺?哪些guardees可以作為效應(yīng)子目標(biāo)結(jié)構(gòu)的平臺?
