ceRNA（competitive endogenous RNA，競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA）假說(shuō)是哈佛醫(yī)學(xué)院Pier Paolo Pandolfi研究小組在2011年提出的，它是一種基因表達(dá)調(diào)控模式导绷，共享miRNA結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同的miRNA悠砚，由此調(diào)控彼此的表達(dá)水平。ceRNA的機(jī)制煤惩，一是當(dāng)ceRNA表達(dá)沉默時(shí)，mRNA被轉(zhuǎn)錄并輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在那里它被miRNA介導(dǎo)沉默復(fù)合物(miRNA-RISC)靶向汽纤，導(dǎo)致加速降解、阻斷翻譯和降低表達(dá)福荸；二是當(dāng)ceRNA表達(dá)激活后蕴坪，它就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)miRNA的靶向性和與RISC復(fù)合物的結(jié)合，降低miRNA抑制功能敬锐。miRNA-RISC復(fù)合物與基因隔離背传，導(dǎo)致基因表達(dá)增加。ceRNA假說(shuō)認(rèn)為台夺，內(nèi)源性RNA分子具有miRNA作用位點(diǎn)径玖，可以競(jìng)爭(zhēng)性的與miRNA結(jié)合，從而間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)谒养，這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA的作用又被叫做miRNA海綿作用（microRNA sponges）挺狰。
ceRNA假說(shuō)自提出以來(lái)，就引起了科研研究者的廣泛注意买窟。ceRNA 假說(shuō)的提出賦予了mRNA和非編碼RNA更為廣泛的生物學(xué)意義丰泊，通過(guò)RNA-RNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用，如它有潛力解釋數(shù)千種尚未鑒定的lncRNA的大部分功能始绍。雖然已經(jīng)有大量的研究結(jié)果為ceRNA假說(shuō)提供了相關(guān)支持瞳购，但是也存在相關(guān)的質(zhì)疑。Nature Reviews Genetics發(fā)表的文章Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy亏推，分六個(gè)部分評(píng)估了支持和反對(duì)ceRNA假說(shuō)的一些證據(jù)和內(nèi)源性miRNA海綿（miRNA sponge）互相作用的影響学赛。相關(guān)概念
1年堆、microRNAs(miRNAs) 是小的非編碼RNA（長(zhǎng)20-22個(gè)核苷酸），通過(guò)引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）靶向靶基因來(lái)抑制基因表達(dá)盏浇，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑变丧。miRNA通過(guò)指導(dǎo)RISC靶向mRNA來(lái)控制基因表達(dá)，從而引起RNA降解或翻譯抑制绢掰。在蛋白質(zhì)組學(xué)痒蓬，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和AGO免疫沉淀研究的支持下，miRNA能夠靶向數(shù)百種基因滴劲，這使其具有調(diào)控至少三分之二的真核轉(zhuǎn)錄組的潛力攻晒。
2、long non-coding RNAs(lncRNAs) 長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA班挖，很少或沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼潛能的轉(zhuǎn)錄物鲁捏。根據(jù)長(zhǎng)度從而將它們與mRNA和小型非編碼RNA（例如miRNA，snoRNAs和tRNAs）區(qū)分開(kāi)來(lái)萧芙。lncRNA作用機(jī)制如：A) 作為順式/反式作用因子調(diào)控gene表達(dá)给梅；B) 通過(guò)改變?nèi)旧w重塑和組蛋白修飾，調(diào)控基因表達(dá)末购；C) 調(diào)控選擇性剪切破喻；D) 生成小的雙鏈內(nèi)源性干擾RNA，如siRNA盟榴；E) 調(diào)控蛋白活性曹质；F) 作為大分子復(fù)合物或細(xì)胞組分支架RNA或組成部分；G) 改變蛋白定位擎场；H) 生成小單鏈ncRNA羽德，如miRNA。
3迅办、circular RNAs(circRNAs)主要由自可變剪接的非規(guī)范形式產(chǎn)生宅静，即一個(gè)外顯子的剪接供體位點(diǎn)與上游外顯子的剪接受體位點(diǎn)連接。盡管circRNA是由外顯子序列構(gòu)成站欺，但是一般并不翻譯成蛋白姨夹。circRNA呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)比線性轉(zhuǎn)錄本對(duì)核酸外切酶的抵抗力更高，因此更穩(wěn)定矾策，這被認(rèn)為比線性轉(zhuǎn)錄本能夠更有效地抑制miRNA活性磷账。
4、pseudogene是通過(guò)與其親本基因的DNA同源性鑒定贾虽，但具有進(jìn)化獲得的突變逃糟。假基因是基因的簡(jiǎn)并拷貝，主要通過(guò)DNA復(fù)制（重復(fù)的假基因）和細(xì)胞RNA的逆轉(zhuǎn)座（加工的假基因）合成。
5绰咽、antisense RNA是指與mRNA互補(bǔ)后菇肃，能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因的表達(dá)的RNA。它封閉基因表達(dá)取募，具有特異性強(qiáng)琐谤、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可用來(lái)治療由基因突變或過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的疾病和嚴(yán)重感染性疾病矛辕。
6笑跛、competitive endogenous RNA(ceRNA) 付魔，是miRNA靶向的轉(zhuǎn)錄物聊品，它不是某一種RNA分子，其可以包括mRNA几苍、假基因轉(zhuǎn)錄物翻屈、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）等。在這種情況下妻坝，它可以隔離結(jié)合的miRNA的活性伸眶，從而有效地抑制該miRNA的其他靶標(biāo)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)microRNA結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致靶基因表達(dá)上調(diào)的RNA刽宪。
7厘贼、ceRNA network通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)相同的單個(gè)miRNA或miRNA集合，協(xié)同隔離miRNA活性的轉(zhuǎn)錄本的相互作用的網(wǎng)絡(luò)圣拄。通常包含四種RNA（mRNA嘴秸、miRNA、lncRNA和circRNA）庇谆，其中mRNA的數(shù)量占大多數(shù)岳掐，而miRNA處于調(diào)控的核心地位，當(dāng)miRNA被lncRNA或circRNA這類(lèi)ceRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合時(shí)饭耳，受miRNA調(diào)控的mRNA轉(zhuǎn)錄水平會(huì)上升串述。
Part1：人工miRNA抑制劑
目前最常用的miRNA抑制工具是反義寡核苷酸（Anti-miR， Antagomir）和miRNA海綿（miRNA sponge）寞肖。通過(guò)引入反義寡核苷酸或通過(guò)過(guò)表達(dá)含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因載體來(lái)抑制miRNA「傩铮現(xiàn)在反義RNA作為miRNA抑制劑在分子研究中是常規(guī)的，并且已經(jīng)將其用作一類(lèi)新型藥物取得了進(jìn)展新蟆。
寡核苷酸miRNA抑制劑通常由小單鏈RNA寡核苷酸組成觅赊，與miRNA幾乎完全互補(bǔ)。對(duì)寡核苷酸進(jìn)行修飾以改善其穩(wěn)定性栅葡，從而提高其功效茉兰。其修飾包括2′-O-甲基化，膽固醇修飾或形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)欣簇，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性规脸。它們通過(guò)轉(zhuǎn)染或在體內(nèi)通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞坯约。此外，納米顆粒載體已被開(kāi)發(fā)用于組織特異性遞送作為治療莫鸭。
miRNA海綿是人為構(gòu)建的表達(dá)3′UTRs闹丐，包含多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的載體，在強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)被因，競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合目的miRNA卿拴，從而將靶mRNA去抑制。與反義寡核苷酸相比梨与，這種miRNA海綿的優(yōu)勢(shì)在于堕花，它有可能被U6或巨細(xì)胞病毒(CMV)等啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)可調(diào)控的粥鞋、穩(wěn)定的表達(dá)缘挽，而這些啟動(dòng)子是哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中最強(qiáng)的表達(dá)驅(qū)動(dòng)因子之一。
人工反義RNA作為miRNA抑制劑的廣泛應(yīng)用呻粹，證明了RNA競(jìng)爭(zhēng)的基本生化原理壕曼。然而，它們的應(yīng)用并不局限于生理表達(dá)水平等浊，因?yàn)橥ǔＳ糜趍iRNA敲除實(shí)驗(yàn)的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了高表達(dá)的miRNA的總細(xì)胞濃度腮郊。使用反義miRNA抑制劑的研究表明了高抑制劑濃度對(duì)有效沉默miRNA的必要性。無(wú)論采用何種方法筹燕，引入的人工miRNA抑制劑的療效都取決于其在細(xì)胞中的濃度轧飞，而濃度的高低又直接受到抑制劑穩(wěn)定性的影響。然而庄萎，由于轉(zhuǎn)染后的寡核苷酸在溶酶體等非功能囊泡中積累踪少，因此很難測(cè)量其功能量，從而在整個(gè)細(xì)胞裂解后人為地提供了高定量糠涛。盡管達(dá)到了非生理學(xué)的高水平援奢，人工miRNA海綿只能部分抑制，通常對(duì)高表達(dá)的miRNA的抑制不超過(guò)50%忍捡。Part2：ceRNAs的實(shí)驗(yàn)證據(jù)
ceRNA假說(shuō)的一個(gè)吸引人的方面是集漾，它提供了一種通過(guò)識(shí)別的假定的miRNA結(jié)合位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)任何RNA轉(zhuǎn)錄本非編碼功能的途徑。ceRNAs的實(shí)驗(yàn)在最基本的層面上砸脊，識(shí)別ceRNA相互作用可假定的ceRNA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的表達(dá)增加具篇，或觀察當(dāng)ceRNA被抑制時(shí)的相互關(guān)系，可以采用qRT-PCR或western blot測(cè)量基因表達(dá)凌埂。進(jìn)一步為了證明表達(dá)的變化是miRNA競(jìng)爭(zhēng)的直接結(jié)果驱显，可以進(jìn)行同時(shí)敲除特定的miRNA和/或小RNA生物合成所需的細(xì)胞成分的實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)。用于識(shí)別和驗(yàn)證ceRNA相互作用的其他實(shí)驗(yàn)策略在很大程度上模擬了用于識(shí)別miRNA靶標(biāo)的策略。這些方法包括在體內(nèi)或體外干擾miRNA水平埃疫，然后進(jìn)行基因表達(dá)分析伏恐，以評(píng)估競(jìng)爭(zhēng)性靶基因的協(xié)同下調(diào)。
目前已由實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持的ceRNA主要有以下幾種：
1栓霜、假基因作為ceRNA：由于假基因的起源是基因拷貝翠桦，所以它們與它們的同源基因具有高度的序列同源性。因此胳蛮，一個(gè)表達(dá)的假基因?qū)⒐蚕韒iRNA的靶位销凑，這些靶位可以競(jìng)爭(zhēng)miRNA的結(jié)合，如PTENP1仅炊、OCT4P4等斗幼。但這些觀察結(jié)果推廣到所有其他轉(zhuǎn)錄的假基因幾乎沒(méi)有依據(jù)的。同樣假基因的穩(wěn)態(tài)表達(dá)水平很少達(dá)到其親本基因的表達(dá)水平茂洒，大多數(shù)個(gè)體的偽基因表達(dá)過(guò)低孟岛，不能作為可行的競(jìng)爭(zhēng)目標(biāo)，但原則上可以累積表達(dá)序列非常相似的假基因督勺，以達(dá)到足夠的靶位點(diǎn)豐度，充當(dāng)ceRNAs斤贰。
2智哀、circRNA作為ceRNA：circRNA因?yàn)樗鼈儧](méi)有易被外切酶消化的游離端從而比線性轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定得多，這是一種特性荧恍，被認(rèn)為有助于它們作為miRNA海綿的有效性瓷叫，如實(shí)驗(yàn)證實(shí)cIRS?7(CDR1?AS)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控miR-7的活性。
3送巡、mRNA作為ceRNA：PTEN的研究等研究結(jié)果觀察到3′UTR的單獨(dú)表達(dá)能夠引起ceRNA效應(yīng)摹菠，這表明編碼轉(zhuǎn)錄本具有非編碼功能，也可通過(guò)ceRNA機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)量骗爆。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明次氨，來(lái)自同一位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本可以通過(guò)獨(dú)立的機(jī)制發(fā)揮多種功能，包括蛋白編碼和非編碼功能摘投。
4煮寡、病毒microRNA海綿：已知病毒利用各種不同的機(jī)制來(lái)操縱宿主基因的表達(dá)，尤其是使用非編碼RNA的機(jī)制∠簦現(xiàn)在有越來(lái)越多的證據(jù)表明幸撕，病毒會(huì)產(chǎn)生作為miRNA海綿的非編碼RNA，這為ceRNA機(jī)制提供了有趣的適應(yīng)性外臂，可以解釋ceRNA活性的增加坐儿，如兩種病毒snRNAs均下調(diào)宿主miRNA的報(bào)道首次揭示了病毒通過(guò)miRNA海綿機(jī)制控制宿主表型的潛力。
Part3：ceRNA網(wǎng)絡(luò)
1、轉(zhuǎn)錄組廣泛的RNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA的證據(jù)貌矿。
大多數(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ceRNA相互作用的證據(jù)都是針對(duì)ceRNA - target對(duì)評(píng)估一個(gè)或幾個(gè)miRNAs累铅。由于實(shí)驗(yàn)的局限性，直接的ceRNA相互作用的演示通常局限于單個(gè)基因站叼。但通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)娃兽、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和AGO免疫沉淀研究表明，單個(gè)的miRNA能夠靶向數(shù)百個(gè)基因尽楔。
2投储、 ceRNA相互作用的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
一個(gè)廣泛影響轉(zhuǎn)錄組的巨大ceRNA網(wǎng)絡(luò)的潛力也開(kāi)始被推測(cè)，尤其是通過(guò)使用先前開(kāi)發(fā)的用于預(yù)測(cè)miRNA靶標(biāo)的生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)ceRNA相互作用阔馋。目前使用最廣泛的miRNA靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)算法是在miRNA的5 ''端即種子區(qū)和靶mRNA的3 '' UTR之間尋找進(jìn)化保守的6個(gè)核苷酸的相互作用玛荞。利用miRNA靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)算法，如TargetScan和miRanda呕寝，一些研究開(kāi)發(fā)了ceRNA相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)勋眯，如ceRDB，lnCeDB下梢，Linc2GO客蹋，miRcode， DIANA-LncBase Predicted孽江，LncACTdb等讶坯。
3、利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)建立ceRNA網(wǎng)絡(luò)模型
原則上岗屏，可以通過(guò)列出所有miRNA-target對(duì)辆琅，并評(píng)估同一miRNA靶向的mRNA在表達(dá)上的相關(guān)性是否更顯著來(lái)評(píng)估ceRNAs對(duì)基因的調(diào)控程度。miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的比較表明这刷，miRNA和預(yù)先確定的靶標(biāo)更可能具有負(fù)相關(guān)的基因表達(dá)婉烟，這與miRNA –靶基因?qū)Φ念A(yù)期一致。
Part4：轉(zhuǎn)錄組廣泛的RNA競(jìng)爭(zhēng)
1暇屋、內(nèi)源性基因全轉(zhuǎn)錄組RNA大量存在可以降低miRNA活性似袁。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組靶豐度預(yù)測(cè)和miRNA活性高通量分析，可以觀察到大量?jī)?nèi)源性靶點(diǎn)對(duì)miRNA活性的抑制作用率碾。還注意到miRNA活性與miRNA豐度之間的相關(guān)性較弱叔营。
2、靶點(diǎn)越多所宰，過(guò)表達(dá)的miRNA活性越低绒尊。測(cè)量大量?jī)?nèi)源性靶點(diǎn)的抑制作用的另一種方法是將預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)豐度與miRNA過(guò)度表達(dá)后的靶點(diǎn)抑制進(jìn)行比較。預(yù)測(cè)到更多的靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄物時(shí)仔粥，miRNA的效力可以被降低婴谱。
3蟹但、生理上ceRNA的表達(dá)變化并不影響高表達(dá)的miRNA。只有當(dāng)miRNA-target的摩爾比例達(dá)到一致時(shí)谭羔，ceRNA才能達(dá)到最好的抑制效果华糖。
4、大多數(shù)個(gè)體靶點(diǎn)的豐度不足以改變活性的miRNA瘟裸。這些實(shí)驗(yàn)支持了miRNA-target比值決定了靶抑制對(duì)靶競(jìng)爭(zhēng)的敏感性的假設(shè)客叉。除了目標(biāo)池異常小且ceRNA具有高親和力的極端情況外，大多數(shù)活性miRNA的高豐度不太可能受到ceRNA競(jìng)爭(zhēng)的影響话告。
Part5：增強(qiáng)ceRNA活性的模型
化學(xué)計(jì)量的ceRNA相互作用模型與實(shí)驗(yàn)報(bào)道的單個(gè)ceRNA的數(shù)量之間存在明顯的脫節(jié)兼搏。雖然評(píng)估轉(zhuǎn)錄組范圍目標(biāo)豐度的模型表明，單個(gè)轉(zhuǎn)錄本在生理上無(wú)法達(dá)到引發(fā)競(jìng)爭(zhēng)所需的豐度沙郭，但得到實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持的報(bào)告正在增多佛呻。這受益于分子模型，可以更好地描述ceRNA活性如何能被增強(qiáng)病线，而不僅僅是豐度的函數(shù)吓著。轉(zhuǎn)錄組范圍的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型通常依賴(lài)于錯(cuò)誤的假設(shè)，即細(xì)胞類(lèi)似于水溶液送挑。一個(gè)相關(guān)的論點(diǎn)解釋了低豐度轉(zhuǎn)錄本和功能之間的不一致绑莺，即區(qū)域化或亞細(xì)胞定位將增加活動(dòng)部位的RNA濃度。這一觀點(diǎn)相關(guān)文章中得到了重申让虐，推測(cè)將miRNA捕獲在P-bodies或miRNA介導(dǎo)的RNA衰變的其他位點(diǎn)會(huì)增強(qiáng)ceRNA的調(diào)節(jié)紊撕。這一概念堅(jiān)持認(rèn)為lncRNA可以表現(xiàn)出高度特異性的定位和表達(dá)模式。然而赡突，這提出了一個(gè)問(wèn)題: 發(fā)生ceRNA活性的亞細(xì)胞位置是什么?AGO免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用非常適合于識(shí)別活性ceRNAs的特定亞細(xì)胞定位。通過(guò)亞細(xì)胞定位來(lái)豐富表達(dá)的潛力仍然是增強(qiáng)ceRNA功能的一個(gè)論據(jù)区赵〔宴郑可以合理地推測(cè)，ceRNA活動(dòng)的共分化仍有可能獨(dú)立于RISC復(fù)合體而發(fā)生笼才。我們也經(jīng)常觀察到lncRNA表達(dá)可以受到高度的時(shí)間調(diào)控漱受，導(dǎo)致其表達(dá)協(xié)調(diào)一致性，這提示我們lncRNA表達(dá)協(xié)調(diào)可能通過(guò)高度調(diào)控miRNA及其競(jìng)爭(zhēng)靶點(diǎn)的共表達(dá)來(lái)增強(qiáng)ceRNA活性骡送。
另一個(gè)影響ceRNA活性的因素是ceRNA的穩(wěn)定性昂羡，它被認(rèn)為是設(shè)計(jì)人工寡核苷酸miRNA抑制劑時(shí)的一個(gè)重要考慮因素。內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性是高度可變的摔踱，因?yàn)閮?nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)成分具有更大的穩(wěn)定性虐先，如發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)或circRNA，對(duì)外切酶的敏感性要低得多派敷。同樣蛹批，miRNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)背景撰洗，例如由3′UTR亞型提供的結(jié)構(gòu)背景，被認(rèn)為是影響miRNA結(jié)合的因素腐芍。這是通過(guò)觀察得到的支持差导，當(dāng)靶區(qū)不穩(wěn)定時(shí)，如AGO2切割的完美互補(bǔ)靶區(qū)猪勇，miRNA被隔離的可能性更小设褐。不完全堿基配對(duì)已被證明可以增加miRNA的結(jié)合，其時(shí)間是完全互補(bǔ)靶點(diǎn)的20倍泣刹。
最近還有幾種分子途徑被描述助析，它們解釋了ceRNA機(jī)制的微妙調(diào)控是如何通過(guò)下游過(guò)程被放大的。例如项玛，miRNA與低表達(dá)lncRNA競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子適度上調(diào)可能通過(guò)向多效靶點(diǎn)發(fā)送信號(hào)放大了下游后果貌笨，這一概念被稱(chēng)為通路分歧。另一個(gè)有希望增強(qiáng)ceRNA活性的機(jī)制是HCV RNA襟沮。HCV RNA除了具有有效隔離高度豐富的miR-122的結(jié)合位點(diǎn)外锥惋，miR-122還穩(wěn)定了HCV RNA，構(gòu)成一個(gè)正反饋環(huán)开伏，有效地增強(qiáng)了其ceRNA活性膀跌。Part6：ceRNA驗(yàn)證的局限性
轉(zhuǎn)錄組范圍的建模數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之間的差異是每種方法特有的局限性的結(jié)果。
在此固灵，我們總結(jié)了用于研究ceRNA機(jī)制的實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)方法的顯著局限性捅伤。針對(duì)ceRNA相互作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)的許多局限性包括過(guò)表達(dá)系統(tǒng)缺乏生理相關(guān)性。隨著miRNA模擬物的引入巫玻，很難復(fù)制生理miRNA的表達(dá)丛忆，尤其是當(dāng)轉(zhuǎn)染的寡核苷酸在溶酶體中被收集而不能引起miRNA活性時(shí)，很難直接測(cè)量引入的miRNA的活性仍秤。免疫沉淀技術(shù)能夠定量測(cè)定miRNA和靶基因的內(nèi)源性表達(dá)熄诡，用AGO免疫沉淀技術(shù)對(duì)內(nèi)源性miRNA和其靶基因進(jìn)行定量時(shí)，過(guò)表達(dá)的外源性AGO也可影響內(nèi)源性的RISC活性诗力。此外凰浮，dicer敲除的細(xì)胞系已被廣泛用于證明分子或細(xì)胞機(jī)制對(duì)miRNA的依賴(lài)。Dicer在miRNA生物發(fā)生中的作用已被廣泛認(rèn)識(shí)苇本，但 Dicer的多效性效應(yīng)也被觀察到袜茧，由于基因敲除或siRNA誘導(dǎo)的沉默不能被專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)成兩種功能，因此很難通過(guò)單獨(dú)抑制功能來(lái)區(qū)分mRNA的編碼和非編碼功能瓣窄。
評(píng)估ceRNA活動(dòng)的研究笛厦，尤其是數(shù)學(xué)建模研究的一個(gè)潛在的和壓倒性的局限性是，它們完全依賴(lài)于miRNA–target預(yù)測(cè)算法的應(yīng)用康栈。miRNA預(yù)測(cè)算法的局限性和不足得到了廣泛的認(rèn)識(shí)递递，如：TargetScan僅通過(guò)編碼轉(zhuǎn)錄物的3′UTR來(lái)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因喷橙；PITA、miRanda和TargetProfiler僅考慮了miRNA-target相互作用的可能性登舞。總結(jié)
ceRNA假設(shè)機(jī)制被證明是一把雙刃劍贰逾，盡管它可以提供一種機(jī)制來(lái)解釋任何RNA的功能，但它也必須在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的背景下進(jìn)行仔細(xì)的研究菠秒。了解RNA-RNA競(jìng)爭(zhēng)如何在所有細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本中發(fā)生疙剑，需要應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組水平的方法來(lái)了解miRNA海綿在生理限制下的功能。此外践叠，了解miRNA和ceRNA的化學(xué)計(jì)量是至關(guān)重要的言缤，因?yàn)閙iRNA的效力是由其細(xì)胞豐度決定的，或者更準(zhǔn)確地說(shuō)禁灼，是由其在RISC復(fù)合物中的豐度決定的管挟。這意味著，對(duì)于更活躍的miRNAs弄捕，所需的競(jìng)爭(zhēng)性轉(zhuǎn)錄本數(shù)量要高得多僻孝。研究ceRNA相互作用的實(shí)驗(yàn)操作的局限性需要更嚴(yán)格的評(píng)估。許多研究使用miRNA過(guò)表達(dá)來(lái)研究ceRNA相互作用守谓，使用轉(zhuǎn)染的寡核苷酸抑制劑或表達(dá)載體穿铆。由于這些實(shí)驗(yàn)通常是在生理表達(dá)領(lǐng)域之外，它們高估了ceRNA的潛在活動(dòng)斋荞。綜合考慮相關(guān)證據(jù)發(fā)現(xiàn)荞雏，ceRNA假說(shuō)在miRNA與miRNA靶標(biāo)之間的競(jìng)爭(zhēng)潛力方面具有深遠(yuǎn)的影響，并且在解釋與異常轉(zhuǎn)錄組改變相關(guān)的病理方面顯示出最大的效用平酿，如3′UTRs的廣泛重構(gòu)以及癌癥中觀察到的聚腺苷酸化動(dòng)力學(xué)凤优。
