10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組小試牛刀

編輯：陸瑤

校對：ANIMUS

編者按：腦科學(xué)是全球科研的前沿領(lǐng)域，是大國競爭的“關(guān)鍵領(lǐng)域”周蹭。

腦科學(xué)依然有太多重大問題有待回答笨枯，比如：

認(rèn)知是如何形成的嫉鲸？

靈魂是否存在价说？

人為什么會做夢假颇？

人比黑猩猩少1對染色體胚鸯，基因相似度72%，剩下28%的差異堿基序列何以決定認(rèn)知與智慧的差異笨鸡？

腦組織這一團(tuán)細(xì)胞姜钳，是如何產(chǎn)生思想的？

上升到哲學(xué)層面形耗，物質(zhì)如何決定意識哥桥？

……

直到今天，大腦依然是人類認(rèn)知的“黑洞”激涤∧飧猓科學(xué)界有人將腦科學(xué)稱為“人類科學(xué)最后的前沿”。

愛麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊專注于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)前沿進(jìn)展倦踢，探索心腦血管疾病和癌癥的致病基因送滞、發(fā)病機(jī)制和藥物開發(fā)等，尤其是腦科學(xué)辱挥。作為本刊【Amazing brain】系列第二篇犁嗅，這里解讀應(yīng)用10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究阿爾茲海默癥相關(guān)基因的時間空間表達(dá)譜的文章般贼，助力腦科學(xué)前沿進(jìn)展共享愧哟。

目前，阿爾茨海默埠咔（AD）研究的核心問題之一是Aβ沉積與神經(jīng)退行性變的關(guān)系蕊梧。既往研究觀察到淀粉樣斑塊周圍的炎性樣改變，但對于這一過程中的分子機(jī)制和細(xì)胞間相互作用依舊所知甚少腮介。2020年8月由比利時魯汶VIB大腦與疾病研究中心Mark Fiers和Bart De Strooper和瑞典皇家理工學(xué)院Joakim Lundeberg等人在CELL上發(fā)表題為“Spatial Transcriptomics andIn SituSequencing to Study Alzheimer's Disease.”的文章肥矢，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組（ST）和原位測序技術(shù)（ISS），繪制了AD發(fā)生發(fā)展過程中的時間和空間基因表達(dá)圖譜叠洗，進(jìn)一步揭秘由Aβ沉積誘發(fā)的一系列AD相關(guān)的細(xì)胞和分子變化甘改。

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一灭抑、繪制AD時間空間轉(zhuǎn)錄組圖譜

研究者分別取3十艾、6、12和18月齡的AppNL-G-F（AD模型）小鼠和C57BL/6（正常）小鼠腾节，總共12只忘嫉。每次取材均取腦組織相鄰3片切片荤牍，外側(cè)2張用于HE染色，中間1張用作ST分析（圖1）庆冕。ST共分析20個樣本康吵，得到10327個組織域（Tissue domain，TD），每一個TD中平均檢測到31,283±7,441條UMI和6,578±987個基因，并根據(jù)ALLEN小鼠腦圖譜诗茎，將所有TD匹配至14個腦區(qū)（圖2）。通過對有效spots進(jìn)行降維聚類分析惭载，進(jìn)而比較不同區(qū)域及不同樣本間基因表達(dá)的差異（圖2C和D）。不同解剖部位的TD數(shù)差異較大响巢，比如內(nèi)嗅皮質(zhì)和丘腦分別有112和2114個TD（圖2B）棕兼。最后作者將三個切片對齊，用Aβ負(fù)荷（6E10 staining）抵乓、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）、神經(jīng)元存在（NeuN）和細(xì)胞核（DAPI）來注釋每個TD靶衍。所有信息均在https://www.alzmap.org/灾炭。

使用 t-SNE對10327個轉(zhuǎn)錄組根據(jù)大腦區(qū)域進(jìn)行聚類（圖2C）。覆蓋海馬體體細(xì)胞層（somatic layers of the hippocampus）的轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜和marker基因能清晰地分為CA1颅眶、CA3和DG亞區(qū)蜈出，表明ST足夠強(qiáng)大，能夠識別大腦的精確解剖區(qū)域涛酗。按照年齡和基因型也可進(jìn)行良好的分離（圖2D)铡原。12個月齡和18個月齡的野生型（WT）小鼠的點(diǎn)重疊（圖2D，紫色和紅色）商叹，而AD鼠的轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜在這兩個時間點(diǎn)（黃色和綠色）之間卻有變化燕刻，與這一時期的病理學(xué)進(jìn)展相一致。

圖1 取材過程

圖2 腦區(qū)分布與ST分析結(jié)果

二剖笙、Aβ沉積相關(guān)基因及功能

AppNL-G-F小鼠中的Aβ蛋白沉積始于3個月左右（圖3A）卵洗。作者采用TD中Aβ熒光強(qiáng)度像素的標(biāo)準(zhǔn)差作為Aβ累積指數(shù)，從而區(qū)分Aβ輕度累積區(qū)和Aβ高度積累區(qū)（圖3B）弥咪。計算每個腦區(qū)Aβ累積指數(shù)的平均值过蹂，結(jié)果與Aβ免疫染色結(jié)果一致（圖3A和C），說明Aβ的累積從背側(cè)向腹側(cè)皮質(zhì)聚至、丘腦和海馬體逐漸增多酷勺。

圖3 Aβ負(fù)荷與基因表達(dá)的關(guān)系

為挖掘基因表達(dá)變化，作者進(jìn)行兩種差異基因分析扳躬。第一種比較不同基因型（AppNL-G-F脆诉；C57BL/6）小鼠之間的基因表達(dá)差異(基因型模型)甚亭。第二種研究Aβ積累對基因表達(dá)的影響（Aβ模型）。以Aβ沉積為中心库说，從里到外分別繪制5個濃度梯度環(huán)（R1~R5）狂鞋，篩選R5到R1基因表達(dá)量顯著變化的基因(Aβ模型)。通過RNAscope實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了18個月齡Aβ小鼠模型中表達(dá)紊亂的6個基因（圖3D和E）

作者比較了按照上述“基因型模型”（基因型 axis）之間差異基因的LFC（log2FoldChange）和不同Aβ模型（Aβaxis）之間差異基因的LFC潜的，揭示了隨不同基因型骚揍、Aβ沉積和年齡而變化的基因表達(dá)改變。對這些基因進(jìn)行GOrilla分析啰挪，共得到13個功能亞類（圖4A）信不。其中，抗原處理亡呵、趨化性抽活、溶酶體降解和炎癥在18個月時沿著Aβ軸和基因型軸上調(diào)。

除此之外锰什，研究者還在10327個TD基因表達(dá)譜中下硕，選取表達(dá)波動幅度top 50%的基因，通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）得到12個模塊（圖4B）汁胆。其中梭姓，對Aβ沉積最敏感的分別為紅色和紫色模塊。與上述GO分析一致嫩码，紅色模塊代表髓鞘功能誉尖，沿著Aβ軸，基因表達(dá)量在早期升高铸题、后期下降铡恕。而紫色模塊代表趨化、溶酶體降解丢间、炎癥及抗原處理功能探熔，在早期無明顯變化，而在疾病晚期顯著上調(diào)千劈。

圖4 GO分析與WGCNA分析

三祭刚、Aβ沉積相關(guān)基因的細(xì)胞定位

研究者將WGCNA分析中受Aβ影響最大的2個模塊，第一大變化模塊（紫色模塊）命名為“斑塊誘導(dǎo)基因（PIGs）”墙牌，第二大變化模塊（紅色模塊）命名為“OLIG”模塊涡驮，因其包含165個基因且主要在少突細(xì)胞中表達(dá)。其中喜滨，PIGs模塊共包含57個基因捉捅，GO分析顯示該基因集參與經(jīng)典補(bǔ)體級聯(lián)、補(bǔ)體級聯(lián)觸發(fā)效應(yīng)機(jī)制虽风、內(nèi)吞作用棒口、溶酶體降解寄月、抗原加工呈遞、免疫反應(yīng)无牵、氧化還原過程漾肮。進(jìn)一步研究該模塊的細(xì)胞特征，發(fā)現(xiàn)其與活化小膠質(zhì)細(xì)胞（疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞[DAM]和活化小膠質(zhì)細(xì)胞[ARM]）茎毁、炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)（圖5）克懊。

OLIG模塊共包括165個基因，將OLIG與已發(fā)表的小鼠單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較七蜘，證實(shí)其與少突膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)谭溉，與活化小膠質(zhì)細(xì)胞輕度相關(guān)（圖5）。有意思的是橡卤，在3個月時扮念，OLIG表達(dá)量與Aβ沉積呈正相關(guān)，而18個月時變?yōu)樨?fù)相關(guān)（圖6A和B）碧库，另外柜与，不同腦區(qū)OLIG表達(dá)量與Aβ沉積的相關(guān)性也不同。對此嵌灰，研究者在3月齡AppNL-G-F小鼠腦切片中旅挤，運(yùn)用特異性結(jié)合4種OLIGs基因(Plp1,Mbp,Olig2, andCnp)的探針進(jìn)行RNAscope試驗(yàn)。結(jié)果表明伞鲫，即使在3個月時，上述4個OLIGs基因的表達(dá)量在致密淀粉樣斑塊周圍也顯著減少签舞。因此秕脓，研究者推論：在輕度Aβ暴露下，OLIG模塊中的基因高表達(dá)儒搭，但當(dāng)Aβ沉積達(dá)到某一程度后吠架，OLIG表達(dá)開始減少。

圖5 WGCNA模塊的細(xì)胞特征

圖6 不同時間OLIG模塊表達(dá)量

除此之外搂鲫，研究者進(jìn)一步運(yùn)用ISS技術(shù)傍药，探索和驗(yàn)證淀粉樣斑塊周圍的多細(xì)胞反應(yīng)。ISS使用定制探針魂仍，對18個月齡的AppNL-G-F和WT小鼠腦組織（各2只）進(jìn)行PIG基因集和細(xì)胞標(biāo)記(小膠質(zhì)細(xì)胞：Itgam,Cx3cr1,Csf1r拐辽；星形膠質(zhì)細(xì)胞：Slc1a3、Gfap擦酌、Clu俱诸；神經(jīng)元：Syp; 少突膠質(zhì)細(xì)胞：Plp1）定位，并用每個基因的熒光斑點(diǎn)數(shù)來量化基因表達(dá)赊舶。最終得到在54個PIG基因中睁搭，有51個基因被顯著富集在R1赶诊，而C1qb表達(dá)量在R1中顯著降低，并且园骆，ISS結(jié)果與ST結(jié)果有很好的相關(guān)性（圖8）舔痪。

圖7.以Aβ沉積為中心的濃度梯度模型

圖8.ISS驗(yàn)證PIG基因空間富集情況

為進(jìn)一步將PIGs基因匹配至不同細(xì)胞類型，研究者還開發(fā)了一種方法：根據(jù)每一個熒光點(diǎn)半徑5μm內(nèi)的細(xì)胞標(biāo)記基因的富集情況锌唾，將其分配到某一種細(xì)胞中锄码。最終得到PIG模塊對Aβ的反應(yīng)主要是由小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的鸠珠。比較AppNL-G-F和WT小鼠巍耗，PIGs基因富集到大致相同的細(xì)胞類型（圖9），但部分基因表達(dá)有所改變渐排，如C1qa,Gusb,Hexa,Lgals3bp及Plek基因在AppNL-G-F小鼠中更多地表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞炬太，而Gns,Gpx4及Itgb5更多地表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖9. PIGs基因匹配至不同細(xì)胞類型

四驯耻、相關(guān)基因的表達(dá)量變化

研究者進(jìn)一步探究Aβ沉積與OLIGs基因表達(dá)的相關(guān)性亲族，并依據(jù)Aβ沉積量的由少到多，將ST 分析中的TD分成WT可缚、Q4霎迫、Q3、Q2帘靡、Q1（WT->Q1, Aβ↑）知给。整體來看，這些基因的表達(dá)和連接隨Aβ沉積增加而增加（圖10）描姚。其中涩赢，在輕度Aβ暴露下，OLIG模塊表達(dá)和連接增加轩勘，但在高度Aβ暴露微環(huán)境中筒扒，OLIG模塊表達(dá)減少。因此绊寻，OLIG模塊的部分區(qū)域差異與Aβ暴露有關(guān)花墩。

圖10. PIGs基因表達(dá)的相關(guān)性變化

五、PIG和OLIG模塊在人腦組織中的可視化

最后澄步，研究者在臨床樣本中對小鼠結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證冰蘑，利用3例AD患者和3例非癡呆正常對照的尸檢腦組織額上回樣本進(jìn)行原位測序（in situsequencing, ISS）。其中村缸，納入的AD患者處于疾病終末階段懂缕，病理顯示淀粉樣蛋白C期、神經(jīng)纖維纏繞Ⅴ~Ⅵ期王凑，最終得到45個PIGs人同源基因和42個OLIG人同源基因搪柑。作者還基于ISS比較了人和鼠中PIGs分布的一致性聋丝，發(fā)現(xiàn)大部分PIGs在人中也分布在相同的細(xì)胞類型中。同樣在人類中工碾，PIG模塊的3個子模塊在對照組中由星形膠質(zhì)細(xì)胞（綠色簇）和小膠質(zhì)細(xì)胞（藍(lán)色和橙色簇）表達(dá)（圖11D）弱睦。然而，作者也鑒定出9個PIG在神經(jīng)元中富集（LGMN渊额、HEXB况木、HEXA、CTSB旬迹、CTSA火惊、GNS、GPX4奔垦、CTSD和ITM2B）屹耐，而2個PIG則在少突細(xì)胞中富集（LGALS3BP&CD9）。

最終椿猎，作者在45個可檢測PIGs中只驗(yàn)證成功了18個PIGs在淀粉樣斑塊細(xì)胞處中顯著富集惶岭，包括9個小膠質(zhì)細(xì)胞PIGs、5個星形膠質(zhì)細(xì)胞PIGs和5個表達(dá)于多種細(xì)胞類型的PIGs犯眠。有趣的是按灶，作者發(fā)現(xiàn)在AD患者的小膠質(zhì)細(xì)胞中APOE和ARPC1B表達(dá)顯著，而在AD患者的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NPC2筐咧、S100A6鸯旁、ITGB5、PRDX6和VSIR顯著表達(dá)量蕊，這表明AD患者存在疾病相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞激活羡亩。

通過比較正常對照和AD患者中PIGs和OLIG模塊的細(xì)胞特征（圖11），進(jìn)一步闡述了人腦組織中Aβ相關(guān)分子危融、細(xì)胞表達(dá)變化。

作者強(qiáng)調(diào)雷袋，當(dāng)將這些數(shù)據(jù)與小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較時吉殃，不但應(yīng)考慮到物種差異，而且應(yīng)考慮到楷怒，小鼠模型只反映了淀粉樣斑塊誘導(dǎo)的病理學(xué)現(xiàn)象蛋勺，而在AD病人晚期，病理學(xué)變得復(fù)雜鸠删，并伴有Tau抱完、壞死性凋亡等其他因素的復(fù)合作用，這是在鼠標(biāo)模型中不存在的刃泡。事實(shí)上巧娱，小鼠模型的病理學(xué)結(jié)果反映了疾病的早期階段碉怔。從人腦出現(xiàn)淀粉樣斑塊和神經(jīng)元纏結(jié)到患者最終癡呆，可能需要20年禁添。因此撮胧，人類中自淀粉樣病變后又有許多額外變化發(fā)生，然而老翘，在小鼠中鑒定的PIG和OLIG模塊的許多基因在AD后期才表現(xiàn)出顯著變化芹啥。

圖11.人腦組織中利用ISS技術(shù)可視化PIG和OLIG模塊

六、結(jié)論

本研究展示了ST和ISS技術(shù)在腦疾病相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用铺峭，通過ST得到疾病相關(guān)基因墓怀，再進(jìn)行GO和WGCNA分析，ISS驗(yàn)證卫键，進(jìn)一步揭示AD發(fā)生發(fā)展過程中的細(xì)胞和分子變化機(jī)制傀履。結(jié)果表明，Aβ不是一個“旁觀者”永罚，其沉積的確可誘導(dǎo)斑塊附近所有細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈且綜合的反應(yīng)啤呼。當(dāng)然，未來有待更多研究呢袱，進(jìn)一步確認(rèn)清除淀粉樣斑塊是否可逆轉(zhuǎn)AD病程官扣，以及其最佳干預(yù)時機(jī)。

愛麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊推出【Amazing brain】系列羞福，解讀腦科學(xué)相關(guān)重磅文章惕蹄。

下期預(yù)告：小編解析【Amazing brain】系列第三篇，空間轉(zhuǎn)錄組研究肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）文章治专。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32702314/

參考文獻(xiàn)

1. Chen WT, Lu A, Craessaerts K, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020;182(4):976-991.e19.

2. 中國腦科學(xué)研究主要"勢力"概覽2020版發(fā)布?https://mp.weixin.qq.com/s/57fPBBSKMytOOGz142xglg