前期文章：
- 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質(zhì)粒骨架及其各個(gè)要素的介紹：
解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒 - 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
質(zhì)粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面還夾雜的講過一些piggybac、gateway激率、RMCE的一些內(nèi)容：
基因編輯如何換藥不換湯 -
慢病毒系列也有講過兩篇：
團(tuán)隊(duì)作案HEK293，史上最強(qiáng)搬磚細(xì)胞
不想再用慢病毒了，我還有什么別的選擇嗎茵宪？piggyBac transposon - 此外我們本還有一個(gè)CRISPR screening的專題算撮，只有開頭槽华，未得完善：精準(zhǔn)大海撈針--5. CRISPR screening專題
- 質(zhì)粒系列之再談無(wú)縫連接--Gibson assembly
- Golden Gate，質(zhì)粒改造的王者
在簡(jiǎn)書上更新學(xué)習(xí)筆記的初心是希望大家一起討論學(xué)習(xí)匠襟，集思廣益。每個(gè)人遇到的問題和解決方法都可能不一樣该园，通過互相分享酸舍，達(dá)到學(xué)習(xí)最大化。最近我的簡(jiǎn)書才開始更新里初，在這之前已經(jīng)斷更蠻久了啃勉，雖然我的簡(jiǎn)書平臺(tái)斷更很久，但還時(shí)常能收到評(píng)論或者提問双妨。好多問題都是我未曾考慮過的淮阐，因?yàn)樗麄兊奶釂枺叶嗔艘粋€(gè)思考的角度刁品，受益頗多泣特。因此還是誠(chéng)邀大家多多給我提建議，多多的分享經(jīng)驗(yàn)挑随，在這里先謝過啦群扶！
1. 引子
今天這篇文章是最近一個(gè)讀者的提問引申開來的，而這個(gè)問題其實(shí)被問了不止一次镀裤。
提問者擔(dān)心瞬轉(zhuǎn)不能達(dá)到基因敲除的效果竞阐。如只是回答表面上的問題，可從以下角度思考：
選用的CRISPR-Cas9基因修復(fù)的方式：同源重組修復(fù)（Homology-directed repair暑劝，HDR）還是易出錯(cuò)的非同源末端連接 Non homologous end-joining骆莹，NHEJ。這兩種修復(fù)方式的速率如何担猛？
而這個(gè)問題還有一個(gè)引申的問題：
假如我認(rèn)為瞬轉(zhuǎn)效率不高幕垦，想要使用穩(wěn)轉(zhuǎn)的CRISPR-Cas9方式是否會(huì)更好丢氢？有何潛在的問題？
一直以來我們都知道CRISPR-Cas9的最大的隱患是脫靶效應(yīng)（off-target effect）先改。近幾年來有研究表明CRISPR-Cas9還有其他的隱患疚察，每次這些相關(guān)性文章一發(fā)表，CRISPR相關(guān)公司的股票都會(huì)出現(xiàn)大跌仇奶。今天我們先就脫靶效應(yīng)來聊一聊貌嫡，并且提出檢測(cè)方法。
2. HDR還是NHEJ
2.1 CRISPR-Cas9不僅僅是切割该溯，還有修復(fù)
從CRISPR-Cas9的名稱來看岛抄，我們很容易理解這是一個(gè)由CRISPR記賬小本本轉(zhuǎn)出來的gRNA介導(dǎo)Cas9切割靶基因的故事。需要注意的是狈茉，這個(gè)切割是一種DNA雙鏈斷裂（double-strand break夫椭，DSB），因此修復(fù)方式一般有HDR氯庆、NHEJ以及MMEJ蹭秋。關(guān)于這幾種DNA修復(fù)方式的不同可以參考我們之的文章，內(nèi)有詳細(xì)介紹：CRISPR-Cas9實(shí)驗(yàn) 堤撵，順利的話扎實(shí)感凤，不順利扎心。
三種DSB修復(fù)方式對(duì)比如下**
（1）MMEJ不能像HDR那樣完美的精準(zhǔn)修復(fù)粒督，但它卻比NHEJ更容易預(yù)測(cè)陪竿，DSB兩側(cè)的短同源區(qū)域（5-25 bp）可以定位到基因編輯的目標(biāo)DNA序列，即<u>精準(zhǔn)度：HDR > MMEJ > NHEJ</u>屠橄。
（2）但對(duì)于沒有良好HDR系統(tǒng)的物種族跛，即使存在修復(fù)模板，其修復(fù)方式仍然是NHEJ锐墙；
（3）HDR的同源性越長(zhǎng)礁哄，重組效率越高，但同源臂越長(zhǎng)溪北，克隆時(shí)間就越長(zhǎng)桐绒。相比之下，MMEJ的短同源序列較易通過PCR擴(kuò)增得到之拨。<u>效率和簡(jiǎn)單程度：NHEJ > MMEJ > HDR</u>茉继；
（4）NHEJ雖然效率高，但是易出錯(cuò)蚀乔；HDR精準(zhǔn)度最高但是效率卻最低烁竭；因此在MMEJ活性允許的情況下，也可以達(dá)到敲入吉挣、替代或刪除核苷酸的效果派撕，但效率低于NHEJ婉弹；
（5）NHEJ、MMEJ活躍于整個(gè)細(xì)胞周期终吼，而HDR則僅在S后期-G2期镀赌，這也是NHEJ效率更高的原因之一。
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由此可見际跪，選用NHEJ修復(fù)導(dǎo)致移碼突變商佛，以達(dá)到基因敲除的方法。NHEJ活躍于整個(gè)細(xì)胞周期垫卤，只要細(xì)胞被轉(zhuǎn)入gRNA-Cas9質(zhì)粒，幾乎在24小時(shí)內(nèi)可以完成基因編輯出牧。因此從速率上并不需要太擔(dān)心穴肘，反而為提高單克隆篩選效率，應(yīng)著重提升質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率舔痕∑栏В可通過從以下角度調(diào)整：
（1）降低細(xì)胞接種密度至30-50%。
（2）選用合適的轉(zhuǎn)染試劑伯复，并給足量慨代，如干細(xì)胞可選用Lipofectamine Stem。
（3）選用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液啸如，如用OPTI-MEM代替無(wú)血清培養(yǎng)基侍匙。
（4）將成團(tuán)細(xì)胞單細(xì)胞化接種，使用胰酶消化團(tuán)塊細(xì)胞至單個(gè)叮雳，吹打混勻后接種時(shí)可加入Rock Inhibitor想暗，可保持細(xì)胞接種存活率，同時(shí)維持細(xì)胞單細(xì)胞化帘不。
綜上所述说莫，瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒不存在KO不掉的問題。
3. 瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)
即使瞬轉(zhuǎn)不存在KO效率問題寞焙，但瞬轉(zhuǎn)必然會(huì)涉及到單細(xì)胞克隆的挑選储狭。為避免這一繁雜的步驟，不少人選擇使用慢病毒轉(zhuǎn)gRNA-Cas9的方式捣郊，通過藥篩可以獲取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株辽狈，并最終得到KO細(xì)胞株。
首先呛牲，嚴(yán)格來說稻艰，使用慢病毒獲取穩(wěn)轉(zhuǎn)gRNA-Cas9細(xì)胞株也需要挑選單克隆細(xì)胞，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)侈净。
其次尊勿，慢病毒轉(zhuǎn)染有多種方式僧凤，不同方式有不同的后果：
（1）穩(wěn)轉(zhuǎn)gRNA-Cas9細(xì)胞株會(huì)存在不斷切割的情況，此時(shí)脫靶效應(yīng)也會(huì)累積元扔，對(duì)研究產(chǎn)生無(wú)法預(yù)計(jì)的影響躯保。
（2）慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9，必要時(shí)加入gRNA瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒澎语，以控制基因編輯脫靶效應(yīng)途事。事實(shí)上有文章表明僅僅是Cas9的過表達(dá)都會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響，我們將在下一篇推文介紹這篇文章內(nèi)容擅羞。
（3）慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)gRNA尸变，必要時(shí)加入Cas9瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒或者蛋白减俏，以達(dá)到基因敲除時(shí)間點(diǎn)的控制和減少脫靶效應(yīng)召烂。
還有一種是財(cái)大氣粗：無(wú)論瞬轉(zhuǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)都不選，直接投放體外制備的gRNA-Cas9蛋白復(fù)合物即可娃承。
講了這一些奏夫，似乎本人很不推薦穩(wěn)轉(zhuǎn)這種方法？其實(shí)這依據(jù)個(gè)人的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇历筝。那些需要有穩(wěn)定基因背景的研究來說酗昼，最好的選擇是快敲不殘留的方法（瞬轉(zhuǎn)）。對(duì)于追求速度梳猪，不拘泥于什么基因敲除效果麻削，尤其是文庫(kù)篩選（CRISPR-Cas9 library screening），則使用慢病毒的方式是相對(duì)適宜的春弥。選用哪種方式碟婆，需要多多考量。
4. CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種多功能的基因組編輯工具惕稻，因?yàn)樗軌蚋咝У匕邢蚺c其gRNA互補(bǔ)的DNA序列竖共。
然而，已有研究表明俺祠，RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶能夠切割與引導(dǎo)鏈不匹配的基因組DNA序列公给。這就造成了脫靶效應(yīng)。由于脫靶效應(yīng)的存在蜘渣，其實(shí)大家在拿到成功的基因敲除細(xì)胞之后淌铐，還需要做脫靶效應(yīng)預(yù)測(cè)并使用桑格測(cè)序驗(yàn)證。有不少網(wǎng)頁(yè)工具可以使用蔫缸，這里以張峰實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站上列出的工具為例腿准。
Off-spotter
界面：這個(gè)工具相對(duì)直觀，只需要設(shè)定種屬、Cas蛋白類別吐葱，給定gRNA序列以及限定堿基錯(cuò)配數(shù)量即可街望。而其推測(cè)的脫靶結(jié)果也十分直觀，感興趣可以自行到官網(wǎng)查詢弟跑。
Cas-OFFinder
界面：Cas-OFFinder可選擇的內(nèi)容比Off-spotter要多灾前，界面也很直觀。但相對(duì)Off-Spotter來說孟辑，增加了DNA/RNA Bulge的選項(xiàng)哎甲。
DNA/RNA bulge：與gRNA匹配時(shí)，當(dāng)DNA序列包含插入(DNA隆起)或缺失(RNA隆起)時(shí)饲嗽，基因組位點(diǎn)可以被CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割炭玫，用于配對(duì)切割的Cas9 nickases也可以容忍其中一條引導(dǎo)鏈的隆起。該文章發(fā)表于2014年的Nucleic Acid Res貌虾，標(biāo)題為CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences吞加，直觀來看，可如下圖：
結(jié)果顯示：Cas-OFFinder的結(jié)果界面更為復(fù)雜酝惧。目前我會(huì)選在排名前10的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證榴鼎。優(yōu)先選擇mismatch最少的target伯诬。而后可能考慮DNA/RNA bulge晚唇。還是一樣的設(shè)計(jì)PCR引物，將目的位點(diǎn)擴(kuò)增并送桑格測(cè)序盗似。
5. 結(jié)語(yǔ)
在理想狀態(tài)下哩陕，我們希望基因編輯后的細(xì)胞沒有脫靶效應(yīng)、核型正常赫舒。但意外是有發(fā)生悍及，建議在拿到單克隆細(xì)胞株并通過桑格測(cè)序后，盡快進(jìn)行核型分析接癌。我們的經(jīng)驗(yàn)表明心赶，即使編輯的基因沒有影響基因組穩(wěn)定性的作用，還是有可能發(fā)生核型改變缺猛。趁早完成缨叫，以放心進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
在這篇文章我們只提到了脫靶效應(yīng)荔燎，實(shí)際上由于CRISPR-Cas9造成的缺口是DSB耻姥，這必然會(huì)引起P53相關(guān)的DNA損傷反應(yīng)，這是CRISPR-Cas9應(yīng)用的隱患之一有咨；另外琐簇，Cas9穩(wěn)定表達(dá)同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響，增加CRISPR-Cas9的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)座享。由于篇幅有限婉商，在這邊文章我們不再展開似忧，下一次我們會(huì)挑經(jīng)典的文章進(jìn)行介紹，并解釋原因据某。最后橡娄，之前挖的Gateway克隆的坑一定會(huì)找時(shí)間補(bǔ)上。謝謝大家哦癣籽！
