簡介和前期文章
我對之前的所有教程進(jìn)行了再次詳細(xì)的總結(jié)
CRISPR-Cas9基因編輯之背景介紹及gRNA設(shè)計（上）
CRISPR-Cas9基因編輯之gRNA設(shè)計（下）
CRISPR-Cas9基因編輯3--sgRNA-Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
前言：
在上一篇文章中我們使用Golden Gate assembly（好奇這是什么的話盗迟，可以去谷歌哦）的方法完成了sgRNA-Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建，在簡書上有收到評論說使用T4 PNK做sgRNA失敗但找不到原因嘹悼。師兄DZ根據(jù)張峰組protocol調(diào)整后的質(zhì)粒構(gòu)建方法，我們從來沒有做失敗過沦寂，突然深感課題組里面有老司機(jī)的重要性，而有時候我們稀疏平常的操作淘衙，其實是前人花費大量時間摸索的結(jié)果传藏，因此我決定把方案寫得更細(xì)一些，希望以后依樣畫葫蘆就能做出來彤守。
實驗正文--酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功與否~ 2-3 h
這是一個很簡單的實驗毯侦，但當(dāng)我是一個分子克隆零基礎(chǔ)的小白的時候，我連酶切是什么都不清楚遗增。因此我認(rèn)為叫惊，就像學(xué)習(xí)生物信息學(xué)一樣，阻擋大家學(xué)習(xí)的不是沒有代碼做修，而是看不懂代碼（代碼無注釋）霍狰。
同樣，網(wǎng)上流傳的各種protocol或許都是可以使用的饰及，但是寫的人或許沒有把實驗方案調(diào)整的背景說出來蔗坯。做一件事情，方法有很多種燎含，但卻沒有解釋為什么宾濒，我相信實驗操作是可以訓(xùn)練完全不會成為問題，看懂protocol也是基本操作屏箍，理解方案設(shè)計绘梦，才是我們最終要掌握的東西。
在這里赴魁，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功卸奉，即確認(rèn)sgRNA是否正確插入到pSpCas9載體中：
（1）最直接的選擇是將質(zhì)粒送樣測序，這種方法最為精準(zhǔn)颖御，但需要等待公司測序結(jié)果并且還需要付費榄棵，對于我所處的課題組來說，不是上上之選（這個我也做過）潘拱；
（2）我們的方法是：在LB平板上挑取2~3個細(xì)胞克隆疹鳄，擴(kuò)增后使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗證質(zhì)粒
還是同一位好學(xué)的小伙伴提了問題芦岂，酶切能看出來20 bp大小的區(qū)別嗎瘪弓？先賣個關(guān)子，看到后面就自然明白為何了
1. 實驗準(zhǔn)備
常規(guī)試劑盔腔、儀器：瓊脂糖凝膠電泳常用試劑耗材杠茬，瓊脂糖凝膠電泳看膠儀器
限制性內(nèi)切酶：實驗室常用限制性內(nèi)切酶月褥，<u>BbsI核酸內(nèi)切酶（貴）</u>
軟件準(zhǔn)備：Snapgene
2. 實驗步驟
（1）設(shè)置實驗反應(yīng)
| Component | Amount (10 μL system) |
|---|---|
| plasmid (NC組弛随、實驗組) | 1 μg |
| 10x NEB buffer (根據(jù)所選內(nèi)切酶匹配不同buffer) | 1 μL |
| BbsI | 0.3 μL (3 units) |
| Bs6I (在質(zhì)粒上僅有一個酶切位點) | 0.3 μL (3 units) |
| ddH2O | up to 10 μL |
（2）37°C incubate 1 hour
（3）瓊脂糖凝膠電泳瓢喉，預(yù)測分子量大小<1 kb，使用 1.52%瓊脂糖舀透；分子量大小為110 kb大小時栓票，選用1-1.2%
（4）結(jié)果分析示例
可見negative control (NC)組，在沒有插入sgRNA時愕够，在兩個酶的作用下走贪，于瓊脂糖凝膠電泳上有明顯可見的兩條帶（還有一條20 bp忽略不計）；
而插入sgRNA之后惑芭，由于BbsI酶切位點被破壞坠狡，此時只有BsrGI一個酶的作用，由于它本身在質(zhì)粒上只有一個酶切位點遂跟，因此它也只能將環(huán)裝的質(zhì)粒逃沿，切開成為鏈狀而已，所以在瓊脂糖凝膠電影上幻锁，僅有一條帶凯亮。
通過分析可知，我挑取的這8個克隆哄尔，全部為成功插入質(zhì)粒假消。
插曲：我在第一次學(xué)做這些實驗的時候，每次都反復(fù)檢查岭接、思考富拗，擔(dān)心自己出錯。所以第一次做的時候鸣戴，不僅僅是通過酶切結(jié)果確認(rèn)插入是否成功啃沪，甚至把質(zhì)粒拿去送測序，經(jīng)由測序確認(rèn)sgRNA的正確插入葵擎，如果有這方面顧慮的小伙伴谅阿，還可以嘗試這個終極的辦法（土豪請隨意）。
注意事項：根據(jù)使用Cas9骨架質(zhì)粒的不同酬滤，選用的核酸內(nèi)切酶也會有所不同签餐，因質(zhì)粒而異，但是最終的目的都是一樣的盯串。質(zhì)粒構(gòu)建成功之后下一步是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染氯檐。
番外：做一手漂亮的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染無壓力的小伙伴可不看）
第一次做質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是2014年，那時候用的還是lipo2000体捏，轉(zhuǎn)shRNA及小干擾RNA（RNAi）冠摄。多年過去糯崎，市面上有了更好的轉(zhuǎn)染試劑，但仍有一部分細(xì)胞的轉(zhuǎn)染難度非常大河泳。本文僅就自己嘗試過的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行簡單介紹沃呢，目前認(rèn)識到的轉(zhuǎn)染方法有：
- 化學(xué)轉(zhuǎn)染法：使用轉(zhuǎn)染試劑打開細(xì)胞膜與核膜，從而輸送質(zhì)粒等物質(zhì)拆挥；
- 電轉(zhuǎn)法：使用電流沖擊致使細(xì)胞穿孔薄霜，質(zhì)粒得以送達(dá)細(xì)胞核。
對于293和部分腫瘤細(xì)胞纸兔，使用羅氏X-tremeGENE及Lipo 3000轉(zhuǎn)染效率可輕松達(dá)到75以上（目測估計惰瓜，如下圖）。對于部分腫瘤細(xì)胞汉矿，尤其是胚胎干細(xì)胞崎坊，轉(zhuǎn)染難度則非常大。以人胚胎干細(xì)胞為例洲拇，細(xì)胞抱團(tuán)生長奈揍、個頭小且核固縮，核膜難以打開呻待，因而使用羅氏X-tremeGENE及Lipo 3000等常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑打月，轉(zhuǎn)染效率幾乎為0。
實驗正文--將sgRNA-pSpCas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293細(xì)胞~ 3-4 days
試劑公司的protocol人人手上都可下載蚕捉，這里將默認(rèn)大家都知道奏篙，只說個人認(rèn)為重要的點，希望能拋磚引玉迫淹，得到大家更多的回復(fù)秘通，分享更好的轉(zhuǎn)染Tips。
1. 實驗準(zhǔn)備
細(xì)胞：293T工具細(xì)胞敛熬，目的細(xì)胞肺稀；
常規(guī)試劑：X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent-Roche （推薦），lipofectamine 3000 （life 公司）应民；Lipofectamine Stem Reagent (干細(xì)胞所需轉(zhuǎn)染試劑）话原，CloneR，Rock Inhibitor（干細(xì)胞相關(guān)需要）诲锹；Opti-MEM培養(yǎng)基
電轉(zhuǎn)試劑盒：可選Bio-Rad和Lonza等公司產(chǎn)品繁仁。
質(zhì)粒準(zhǔn)備：前步驟產(chǎn)生的sgRNA-pSpCas9質(zhì)粒
2. 實驗步驟
（1）轉(zhuǎn)染前優(yōu)質(zhì)狀態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備 Day -3
轉(zhuǎn)染前細(xì)胞狀態(tài)非常重要，當(dāng)然293作為工具細(xì)胞归园，即使兩三天不換液黄虱，細(xì)胞融合度已達(dá)到百分之百，仍然幾乎不影響細(xì)胞狀態(tài)（不建議這么虐待細(xì)胞）庸诱。
對于腫瘤細(xì)胞捻浦，相信肯定有人遇到過晤揣，明明好好呵護(hù)著，但是不知道為啥傳代之后總會半死不活半貼壁的樣子朱灿，這里懷疑是消化多度引起昧识，建議親們降低胰酶濃度或者更換更溫和的胰酶，同時傳代后24小時不要進(jìn)行常規(guī)換液母剥，等到48小時后細(xì)胞可能會貼壁回去滞诺。
當(dāng)然形导，每一種細(xì)胞的特性都不一樣环疼，比如我遇到的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，非常喜歡集中在孔板中間區(qū)域朵耕，如果消化過度則第二天不要換液炫隶，等到貼壁后再換液，狀態(tài)再好總還有一些細(xì)胞圓圓的亮亮的在半貼在上方阎曹。
對于人胚胎干細(xì)胞伪阶，這細(xì)胞非常嬌弱，一來培養(yǎng)基非常貴处嫌，且不能加抗生素栅贴，必須要生長在有feeder cell支持的環(huán)境或Matrigel coated的孔板；二來傳代的時候還不能吹散成單細(xì)胞熏迹，最好是一小簇一小簇的掉下來檐薯，單細(xì)胞狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞非常不易存活（使用Rock Inhibitor可以給單細(xì)胞狀態(tài)人胚胎干細(xì)胞續(xù)命）；再來細(xì)胞培養(yǎng)密度超過70%就有分化的危險注暗。
<u>因此：對于自認(rèn)為狀態(tài)不好控制的細(xì)胞坛缕，在轉(zhuǎn)染前先傳代種板，得到融合度70%左右狀態(tài)良好的細(xì)胞捆昏，再將這些細(xì)胞接種到孔板中赚楚，保證接種后密度~30%，并且是單細(xì)胞狀態(tài)骗卜。</u>
（2）轉(zhuǎn)染前一天 Day -1
將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至六孔板中宠页；人胚胎干細(xì)胞可使用TryPLE消化至單細(xì)胞后，使用帶Rock Inhibitor的培養(yǎng)基接種寇仓。
（3）轉(zhuǎn)染當(dāng)天 Day 0
檢查細(xì)胞狀態(tài)良好举户，且為單細(xì)胞狀態(tài)好，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書準(zhǔn)備DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物焚刺，以下為我使用Lipo3000轉(zhuǎn)染293時所用的條件：
Lipo3000和P3000試劑在使用前已混勻備用（各自震蕩混勻而已敛摘，不是兩個試劑混在一起），Opti-MEM培養(yǎng)基已放置室溫備用乳愉，質(zhì)粒為去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提刃忠（內(nèi)毒素是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要原因屯远，有時候不是Lipo有毒性，而是質(zhì)粒帶毒）
EP管A：Lipo3000 + 125 μL Opti-MEM 混勻備用 Lipo3000的用量可據(jù)實際情況調(diào)整
EP管B：2.5 μg plasmid DNA + 125 μL Opti-MEM+ P3000 混勻
將EP管B混合物稀釋到EP管A中捕虽，輕柔混勻后室溫孵育10 minutes
將plasmid DNA-Lipo 復(fù)合物均勻滴加到細(xì)胞上
注意：在準(zhǔn)備DNA-Lipo復(fù)合物時慨丐，無血清培養(yǎng)基不能代替Opti-MEM，Opti-MEM是增加轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵之一泄私，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞培養(yǎng)基無需更換為無血清培養(yǎng)基房揭。而人胚胎干細(xì)胞則需要使用Lipofectamine Stem這樣專業(yè)的干細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)1-5%晌端，別小看著1-5%捅暴，這是我的命根子，全靠這1%的轉(zhuǎn)染效率咧纠，我才能挑到單克隆的蓬痒。
（4）轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率檢查 Day 1-3
帶熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒可查看熒光表達(dá)情況漆羔，而抗生素標(biāo)簽的梧奢。。演痒。就拿抗生素篩選吧亲轨。個人推薦使用帶熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒，不僅看得到還能流式篩選出來鸟顺，同時可以避免抗生素對細(xì)胞的影響惦蚊。
關(guān)于電轉(zhuǎn)的方法，等積累更好的經(jīng)驗之后我們擇期再說诊沪，主要問題則是試劑太貴养筒，沒有儀器，細(xì)胞損傷大端姚，狀態(tài)不好恢復(fù)晕粪。下節(jié)我們將討論質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后的后續(xù)實驗，再見渐裸。
