In-Fusion方法及引物的設計
本章構建PHD2的重組表達載體時使用的是pET-43.1(+)系列中的pET-43.1b(+)，目的是通過Nus?Tag促進融合蛋白可溶性表達傀缩，His?Tag作為親和標簽用于后期目的蛋白的純化。
2.4.2 In-Fusion方法及引物的設計
2.4.2.1 In-Fusion Cloning方法? 常用的TA克隆部宿、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在連接效率低、需要特定限制性酶切位點以及耗時較長等缺點瓢湃，In-Fusion Cloning方法旨在用一步法將任意DNA片段克隆到任意線性化載體中理张，技術能夠實現0.05-15kb DNA片段的克隆，還可以同時克隆兩個或多個DNA片段绵患，無需亞克隆涯穷。整個過程不附加多余序列，真正意義上實現了完美的無縫克隆藏雏。
目前拷况，In-Fusion技術已被應用到國內外許多科研工作中。Roger等人使用In-Fusion方法實現了DNA片段與載體任意位置的無縫融合掘殴，該方法操作簡便并且易于實自動化赚瘦。Martina等人用In-Fusion方法將目的基因高效地克隆至一些列載體系統(tǒng)上，表達出不同的重組單克隆抗體奏寨，為早期治療及診斷的評估奠定了基礎起意。Chad等人研究發(fā)現牛痘病毒DNA聚合酶可以增大In-Fusion Cloning的反應效率，實現插入序列高通量的定向克隆病瞳。在國內揽咕，張明娟等人首次報道了使用In-Fusion技術將鈉泵α3截斷性片段插入pGEX-6P-1載體中，表達出GST-Trf-α3融合蛋白套菜。劉超等人發(fā)現用T4 DNA連接酶處理后亲善，不能成功地將較大的SCN1A cDNA基因（6.0Kb）克隆至pCMV-IRES-DsRed（5.2Kb）真核載體上，后來改用In-Fusion技術成功地構建了pCMV-SCN1A-IRES-DsRed重組載體逗柴，實現了Ⅰ型鈉通道與紅色熒光蛋白的共表達蛹头。韓凱等人也研究發(fā)現In-Fusion是一種通用、快速、高效的構建重組表達載體的方法渣蜗。
本論文首先通過限制性酶切法得到線性化載體屠尊，設計特異性引物擴增目的基因使其兩端與線性化載體末端具有15個同源序列。然后用PrimeSTAR? HS DNA聚合酶（寶生物公司）進行PCR反應耕拷，充分確保了目的基因的高保真性讼昆。最后用In-Fusion專利酶將帶有同源序列的目的基因與線性化載體融合，Cloning Enhancer的加入消除了PCR反應液中引物二聚體和dNTP等的影響骚烧，該反應只需15min且反應液可以直接轉化大腸桿菌浸赫，無需純化步驟。因此止潘，整個過程實現了PHD2基因快速掺炭、簡單辫诅、高效地克隆至pET-43.1b(+)凭戴，成功構建了pET-43.1b(+)-PHD2原核表達載體。
2.4.2.2 In-Fusion引物的設計? 引物的設計步驟在In-Fusion方法中非常關鍵炕矮，只要插入序列和載體兩端具有至少15bp同源序列么夫，就可以通過In-Fusion反應實現而者的無縫融合。因此肤视，在設計In-Fusion 的PCR引物時档痪，必須使引物末端帶有與線性化載體末端相同的同源序列，In-Fusion引物設計的基本原則是：
（1）引物的5’末端應包含與線性化載體末端相同的15個堿基序列邢滑。
（2）引物的3’末端應滿足以下條件：包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列腐螟；GC含量控制在40~60%；Tm值在58~65℃之間困后，且正向引物與反向引物Tm值差別應小于4℃乐纸；避免含有重復的核苷酸，最后5個核苷酸不要多于兩個G（鳥嘌呤）或C（胞嘧啶）摇予。
（3）避免引物序列之間的互補汽绢，防止發(fā)夾結構及引物二聚體的形成。
本研究使用在線工具http://bioinfo.clontech.com/infusion/侧戴，將pET-43.1b(+)質粒序列宁昭、限制性內切酶SacⅠ及用于擴增目的基因的引物序列輸入相應位置，然后按照一系列步驟及引物設計原則設計出一對特異性In-Fusion引物酗宋，很大程度上簡化了引物設計步驟积仗。
3.4.3融合標簽對目的蛋白的影響
外源蛋白在大腸桿菌中表達時經常會聚集成不溶的包涵體，為后期的純化及活性研究帶來困難蜕猫，而構建融合蛋白是促進外源蛋白可溶性表達的策略之一斥扛。大腸桿菌NusA（N-利用質A）作為一種親水標簽，使一些在大腸桿菌中表達時不溶的蛋白在N端融合NusA后，可以在極大程度上增強融合蛋白的溶解性稀颁。
本研究通過pET-43.1b(+)系統(tǒng)在目的蛋白N端融合了Nus?Tag標簽芬失，成功地以可溶性融合蛋白的形式表達出Nus-PHD2，但融合標簽的加入也不可避免的為目的蛋白的研究帶來一些影響：（1）NusA蛋白作為一種分子量較大的特異性促溶因子匾灶，可能會對目的蛋白的結構產生空間位阻棱烂，影響PHD2的活性；（2）若要切除Nus?Tag標簽阶女，就必須使用成本較高的特異性蛋白酶作用在專一的酶切位點上颊糜，一般酶切步驟還需要進行反應條件的優(yōu)化；（3）融合標簽雖然增大了目的蛋白的表達量及溶解度秃踩，但復雜的純化步驟以及標簽的切割后純化過程會造成目的蛋白的損失衬鱼，使其產量無法滿足后續(xù)研究的要求。?? 融合標簽在外源蛋白表達和純化上的應用是一個不斷探索的過程憔杨，相信隨著對蛋白質結構及包涵體形成機理等方面研究的發(fā)展鸟赫，融合蛋白技術會越來越成熟，在蛋白表達領域發(fā)揮更大的作用消别。
