1. COVID-19和IAV患者外周血PBMC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜
圖A：患者信息：3個(gè)HD，5個(gè)COVID19洞拨，2個(gè)IAV患者；COVID19和IAV各取了不同的時(shí)間點(diǎn)的樣本（見圖COVID-19有6個(gè)時(shí)間點(diǎn)负拟，IAV有3個(gè)）烦衣，一共送了23個(gè)樣。
圖B：23個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)展示掩浙。過濾后得到46,022個(gè)細(xì)胞花吟，平均每個(gè)樣本約200細(xì)胞。??其實(shí)仔細(xì)看樣本間細(xì)胞數(shù)差挺大的厨姚，這個(gè)展示方式比較討巧衅澈，至少看起來比較均一。
圖C：細(xì)胞注釋得到15個(gè)細(xì)胞群
T(CD3G+, CD4+/CD8A+/CD8B+)：naive T cells (CD3+CCR7+GZMA-), activated CD4+ T cells (CD3+CD4+IL7R+), cytotoxic CD8+ T cells (CD3+CD8+GZMA+), mucosal associated invariant T cells (MAIT cells; CD3+SLC4A10+), and cycling T cells (CD3+MKI67+)
B(MS4A1+)：naive B cells (MS4A1+IGHG1-), plasma cells (MZB1+IGHG1+), cycling plasma cells (MZB1+IGHG1+MKI67+TOP2A+), and memory B cells (CD27+MS4A1+IGHG1+)
Mono(LYZ+CD68+)
NK(KLRF1+XCL1+)
DC(CD1C+LYZ+)
megakaryocytes(PPBP)
stem cells(CD34)
圖D：細(xì)胞群marker基因展示（這個(gè)圖感覺畫成氣泡圖或者堆疊條形圖會(huì)更好）
2. 漿細(xì)胞在新冠和IAV患者的外周血中增加
圖A：堆疊條形圖展示23個(gè)樣本15種細(xì)胞的比例變化
圖B：漿細(xì)胞和細(xì)胞周期漿細(xì)胞在COVID-19和IAV感染患者中比例都明顯增加遣蚀，但這兩種疾病之間的漿細(xì)胞比例沒有顯著性差別矾麻。漿細(xì)胞主要作用是產(chǎn)生抗體，其比例的增加可能會(huì)使中和抗體產(chǎn)生增多以保護(hù)機(jī)體芭梯。
圖C：COVID-19的B細(xì)胞和HC的B細(xì)胞相比的上調(diào)基因的富集分析結(jié)果結(jié)果顯示蛋白復(fù)合體組裝和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路被顯著富集险耀。可能的原因是這個(gè)過程中大量蛋白質(zhì)合成增加玖喘。此外還富集到了B細(xì)胞活化相關(guān)通路甩牺。（這里差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)是adjusted p < 0.01, Foldchange > 2，還算是比較嚴(yán)格累奈”崤桑看起來篩出的基因不多急但。富集分析是用ChIPseeker包做的：compareCluster (fun = "enrichGO,’’ pvalueCutoff = 0.1, pAdjustMethod = "BH,’’ OrgDb = "org.Hs.eg.db,ontBP’’) ）
圖D：漿細(xì)胞的特性和功能依賴于轉(zhuǎn)錄因子PRDM1, XBP1和IRF4。和HC相比搞乏，COVID-19這三種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)都顯著增加波桩。
??延伸：
PRDM1has a central role in determining and shaping the secretory arm of mature B cell differentiation and in promoting immunoglobulin (Ig) synthesis.
XBP1is a positively acting transcription factor in the CREB-ATF family that is expressed at a large amounts in plasma cells and is crucial for increasing protein synthesis in plasma cells.
IRF4regulates immunoglobulin class-switch recombination, and sustained and higher concentrations of IRF4 are known to promote the generation of plasma cells.
圖E：激活的CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD2AP和TNFSF14增加，細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNFSF14和KDM5A增加请敦，NK細(xì)胞表達(dá)KDM5A增加镐躲。
??延伸：
CD2AP是CD4+T細(xì)胞的接頭分子，在病毒感染時(shí)參與濾泡輔助性T細(xì)胞Tfh的分化調(diào)節(jié)并促進(jìn)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生侍筛。
TNFSF14促進(jìn)T細(xì)胞活化和外周血T細(xì)胞招募到組織萤皂。
KDM5A編碼的H3K4me3脫甲基酶是NK細(xì)胞和T細(xì)胞活化所需。
總結(jié)：Taken together, these results demonstrated that elevated plasma cells and increased activation of T cells and NK cells in COVID-19 patients may contribute to defense against the virus.
這一部分的分析如D圖和E圖直接挑出某些分子查看表達(dá)邏輯性不強(qiáng)匣椰，這樣做需要很多免疫學(xué)先驗(yàn)知識(shí)裆熙。
3. COVID-19患者的IFN反應(yīng)和淋巴細(xì)胞凋亡
圖A：對(duì)day1 COVID-19患者的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的高表達(dá)基因（和HC相比）進(jìn)行功能富集禽笑，并展示了top20的富集通路入录。
??：這里是把T, B, NK三種細(xì)胞的富集分析結(jié)果各選了前20個(gè)pathhway一起展示的。因?yàn)橛兄貜?fù)的通路蒲每，所以展示了42條通路纷跛。可以借鑒??
response to type I IFN signaling和defense response to virus signaling在T, B, NK細(xì)胞中都被顯著富集喻括。此外邀杏，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和蛋白去折疊相關(guān)通路在B細(xì)胞中被顯著富集。這可能是由于漿細(xì)胞比例增加唬血，抗體合成旺盛所致望蜡。其他的信號(hào)通路包括染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、DNA致密化改變等在SARS-CoV-2感染中也出現(xiàn)了上調(diào)拷恨。相關(guān)基因的功能值得進(jìn)一步探究脖律。
圖B：day1 COVID-19患者的T細(xì)胞、B細(xì)胞腕侄、NK細(xì)胞小泉、DC和單核細(xì)胞的高表達(dá)基因（和HC相比）的火山圖顯示，和富集分析結(jié)果中response to type I IFN signaling被顯著富集相一致冕杠，對(duì)早期抗病毒起到關(guān)鍵作用的ISGs在多種細(xì)胞中都出現(xiàn)了顯著高表達(dá)微姊。在這些ISGs中，ISG15, IFI44L, MX1 和 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-associated factor 1 (XAF1)在T, B, NK, DC細(xì)胞群中都出現(xiàn)了上調(diào)分预。
圖C：在bulk水平上進(jìn)行比較兢交，和HC相比，新冠患者樣本中上述4個(gè)基因也出現(xiàn)了明顯上調(diào)笼痹。
圖D：隨后作者將新冠患者從出現(xiàn)癥狀到出院人為分為了四個(gè)病程stage配喳，并檢測(cè)了這些差異基因在病程中的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化酪穿。結(jié)果得到6個(gè)時(shí)間依賴性表達(dá)模塊。??這里的時(shí)間動(dòng)力學(xué)聚類分析是用Mfuzz做的晴裹。(見Mfuzz)
圖E：對(duì)6個(gè)模塊中的基因進(jìn)行了通路富集分析以探究其生物學(xué)意義
Cluster 3包含158個(gè)基因被济，這些基因隨著病程進(jìn)展表達(dá)量逐漸降低。這些基因的功能富集顯示它們主要與IFN反應(yīng)相關(guān)涧团，提示這些ISG相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是動(dòng)態(tài)變化的溉潭，它們?cè)谠缙诒患せ钜云鸬皆缙诳共《咀饔茫谕砥跁r(shí)間點(diǎn)表達(dá)活性逐漸降低少欺。
Cluster 1包含38個(gè)基因喳瓣，這些基因隨著病程進(jìn)展表達(dá)量逐漸增加。GO富集顯示它們的功能主要與翻譯和蛋白合成相關(guān)通路有關(guān)赞别。這與隨病程進(jìn)展抗體合成增多相一致畏陕。
圖F：HC和COV的CD4+T細(xì)胞部分基因表達(dá)情況顯示TNFSF10 (TRAIL) 和它的受體TNFRSF10A在COV患者的T細(xì)胞中表達(dá)增加。另一個(gè)TNF通路成員TNFRSF1B在COV患者的T細(xì)胞也出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)仿滔。FAS, FASLG, 和FADD（FAS通路相關(guān)）也出現(xiàn)了上調(diào)惠毁。
4. COVID-19患者和IAV患者相比的免疫分子特征
圖A：比較了HC、COVID-19和IAV患者的CD4+T細(xì)胞的因子崎页、細(xì)胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化(NK細(xì)胞和DC細(xì)胞的結(jié)果見supplement)鞠绰。聚類結(jié)果顯示COVID-19患者的免疫細(xì)胞主要編碼促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體和IFN-反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子飒焦。而IAV患者蜈膨，促炎轉(zhuǎn)錄因子和virus-interacting host factors出現(xiàn)明顯高表達(dá)。
在IAV患者的多種免疫細(xì)胞中牺荠，和機(jī)體免疫反應(yīng)相關(guān)的多種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如STAT3, NFKB1和REL都出現(xiàn)了上調(diào)翁巍。NFKB1和REL編碼NF-kB異二聚體的活性亞單位。激活NF-kB信號(hào)通路對(duì)于固有免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)具有重要作用休雌。
在新冠患者的活化CD4陽性T細(xì)胞中灶壶，應(yīng)對(duì)干擾素時(shí)激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3表達(dá)顯著增加（其他細(xì)胞也增加，見supplement）杈曲。
圖B：此前有研究顯示STAT3信號(hào)通路的激活物IL-6和IL-10在IAV患者中高表達(dá)驰凛。圖B顯示和COVID-19和HC相比，HAV感染患者的活化的CD4+T細(xì)胞表達(dá)STAT3增加并且與time post admission相關(guān)担扑。此外和其他組相比恰响，HAV感染患者的活化的CD4+T細(xì)胞高表達(dá)RUNX3。既往文獻(xiàn)報(bào)道RUNX3 induction是CD4+T細(xì)胞獲得細(xì)胞毒性的關(guān)鍵步驟魁亦。
圖C：STAT3和IRF3的表達(dá)在COVID-19中都增加渔隶，STAT3和NFkB表達(dá)在IAV中增加。
Hightlights
- We generated a single-cell atlas of PBMCs in both COVID-19 and influenza patients
- Plasma cells increase significantly in both COVID-19 and influenza patients
- COVID-19 is featured with XAF1-, TNF-, and FAS-induced T cell apoptosis
- COVID-19 activates distinct pathway (STAT1/IRF3) versus influenza (STAT3/NFkB)
