總體思路：
1. Single-Cell Analysis of Pathological Cardiac Hypertrophy in a Mouse Model of Pressure Overload
Fig 1A：送樣流程砸琅，取了0, 2, 5, 8, 11周的TAC小鼠心尖區(qū)和非心尖區(qū)的心肌和非心肌，分別送了單細(xì)胞測(cè)序。
0w：正常對(duì)照竞帽；2w：肥厚with正常EF仅淑；5w：肥厚with異常EF扳还；8-11w：心衰韭寸。
Fig 1B：麥胚凝集素 (WGA)染心肌細(xì)胞膜背零，隨病程進(jìn)展购岗，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯肥大汰聋。
Fig 1C：各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)和心尖區(qū)/非心尖區(qū)，心肌/非心肌數(shù)目統(tǒng)計(jì)喊积。
Fig 1D：所有細(xì)胞UMAP注釋圖烹困，得到6個(gè)細(xì)胞群。
Fig 1F：6個(gè)細(xì)胞群的高變基因熱圖展示乾吻，不同細(xì)胞群間區(qū)分度較好髓梅。熱圖上同時(shí)標(biāo)示了每個(gè)群的marker基因。畫(huà)法之前寫(xiě)過(guò)：ComplexHeatmap繪制帶特定基因的單細(xì)胞熱圖
2. Characterization of Cardiomyocytes at Different Stages of Pressure Overload–Induced Pathological Cardiac Hypertrophy
對(duì)心肌進(jìn)行亞群細(xì)分绎签。
這個(gè)思路值得學(xué)習(xí)先分cluster枯饿，再用Mean spearman cor做相關(guān)性分析來(lái)分功能性亞群，然后做驗(yàn)證诡必。
Fig 2A B：心肌細(xì)胞分成了10個(gè)亞群CM0-9奢方，A是按cluster著色，B是按送樣時(shí)期著色。
Fig 2C：心肌細(xì)胞分成了10個(gè)亞群top marker gene的熱圖（感覺(jué)單看這個(gè)圖的話蟋字，群和群之間的區(qū)分不是很大哎）
作者除了scRNAseq以外也測(cè)了bulkRNAseq稿蹲，用來(lái)驗(yàn)證scRNAseq的結(jié)果。
Supplemental Fig 3A：不同時(shí)期不同樣本的比例餅圖
Supplemental Fig 3B C：B顯示不同時(shí)期的心肌細(xì)胞樣本愉老，兩個(gè)組學(xué)的logTPM相關(guān)度較好场绿。C. ？
Supplemental Fig 3D E：和預(yù)期的一樣嫉入，兩個(gè)肥心相關(guān)基因Nppa和Nppb隨病程發(fā)展逐漸升高焰盗。
Supplemental Fig 3F：Structural 和 calcium handling基因出現(xiàn)先升高后降低
Supplemental Fig 3G：代謝相關(guān)基因在病程中出現(xiàn)持續(xù)降低。
為了 更多的聚焦心肌細(xì)胞的功能咒林，作者根據(jù)transcriptome similarities將心肌細(xì)胞分為了4個(gè)功能性亞群（functional cluster, FC1-4）
Fig 2D E：根據(jù)transcriptome similarities分的四個(gè)FC和對(duì)應(yīng)的代表性基因及通路富集熬拒。參考：不同單細(xì)胞群之間的相關(guān)性分析
FC1 (CM0, 2, 3, and 6)高表達(dá)Lrp5，可能參與tissue remodeling垫竞。FC2 (CM7, 8), 表現(xiàn)出經(jīng)典的心肌細(xì)胞特性澎粟，包括心肌細(xì)胞發(fā)育，代謝和細(xì)胞收縮欢瞪。比較surprising的是FC3 (CM1,4,9)和FC4 (CM5)高表達(dá)經(jīng)典的內(nèi)皮和成纖維的marker活烙，比如Cdh5和Vwf以及Vim和Dcn。各自的功能見(jiàn)圖E遣鼓。
Fig 2F：四個(gè)群的marker基因在10個(gè)cluster的表達(dá)啸盏，輔助驗(yàn)證圖DE
Fig 2G H I J：為了驗(yàn)證FC3和FC4這兩群高表達(dá)經(jīng)典的內(nèi)皮和成纖維的marker的非經(jīng)典心肌（證明不是雙細(xì)胞骑祟，而是確實(shí)表達(dá)了）回懦，用流式（G），譜系示蹤小鼠（H）和單細(xì)胞western blot（I J）做了驗(yàn)證次企。
Fig 2K：不同細(xì)胞群隨時(shí)間變化的proportion change
小結(jié)： Together, these findings highlight the presence of multiple functional cardiomyocyte subtypes and their potential roles in heart function.
3. Characterization of Noncardiomyocytes at Different Stages of Pathological Cardiac Hypertrophy
Fig 3A B C：成纖維分了9個(gè)群怯晕，A圖是每個(gè)群不同時(shí)期的比例變化，高表達(dá)包括Postn在內(nèi)的ECM蛋白的FB1和FB6細(xì)胞群比例增加缸棵，提示心肌肥厚晚期活化的成纖維比例增加舟茶；B圖是每個(gè)群代表基因的熱圖，C是功能富集結(jié)果堵第。
Fig 3D E F：內(nèi)皮細(xì)胞分了9個(gè)群稚晚，和上面三個(gè)圖模式一樣，提示心肌肥厚進(jìn)展過(guò)程中型诚，EC細(xì)胞群出現(xiàn)了功能shift，即從正常心臟中負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的EC2轉(zhuǎn)變成了心衰中參與肌肉細(xì)胞發(fā)育的EC5和EC6鸳劳。
Fig 3G H I：MP分為6個(gè)亞群狰贯，一些MP亞群如MP和MP5表達(dá)一些經(jīng)典的心肌marker，比如Tnnt2，而且顯示出一些心臟收縮涵紊，動(dòng)作電位和血管生成的功能傍妒。中晚期巨噬細(xì)胞主要參與炎癥反應(yīng)，組織重構(gòu)和血管生成摸柄。
小結(jié)：Together, these observations suggested that the functional specifications for noncardiomyocyte cell types are highly dynamic and thus may play active roles in driving disease progression.
4. Subtype Switching of Fibroblasts Highly Correlates With Hypertrophic Responses of Cardiomyocytes at Initial Stage of Cardiac Hypertrophy
病程間非心肌功能出現(xiàn)劇烈變化颤练。因此，進(jìn)一步想要去探究這些非心肌對(duì)心肌功能的影響驱负。
首先對(duì)代表性的早期 (0w和2w) 主要細(xì)胞群 (CM0, CM1, CM2, CM4和CM5) 做了monocle擬時(shí)序分析嗦玖。
用來(lái)做monocle的細(xì)胞群選擇標(biāo)準(zhǔn)：1) The subclusters should account for >10% of total CM cells in any time point. 2) There were at least 10 cells supporting the potential conversion between two sub-clusters. 3) The conversion direction should not be conflicting with the proportion change of the clusters.
Potential cell conversion was calculated according to a previously reported method1.
Supplemental Fig 8A B：5個(gè)心肌細(xì)胞cluster的擬時(shí)序分析，B圖提示跃脊，0w的心肌向2w的心肌分化的時(shí)候存在兩個(gè)分支宇挫。
Supplemental Fig 8C：擬時(shí)差異基因分為了4個(gè)cluster，分別對(duì)這四個(gè)cluster的差異基因做了功能富集酪术。1和2cluster的基因主要調(diào)控是2w-2 CM這個(gè)分支器瘪，參與細(xì)胞外基質(zhì)形成，組織重構(gòu)等過(guò)程绘雁。3和4cluster的基因主要調(diào)控是2w-1 CM這個(gè)分支橡疼，參與肌細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程。這種做完monocle把聚類基因提出來(lái)做富集的方法見(jiàn)：monocle2
隨后庐舟，作者選擇了在0-2w比例上調(diào)(MP3, EC4, T2和FB4)和下調(diào)(EC2, T0, FB3, MP5, EC1和FB5)的主要細(xì)胞群(10群)欣除，做了細(xì)胞互作分析。
??心肌和非心肌的互作的做法：在肥厚的進(jìn)展早期(0-2w)過(guò)程中继阻，作者假定發(fā)生了明顯比例變化的NCM細(xì)胞群最有可能參與調(diào)控CM的變化耻涛。
(1) 首先選取了NCM各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的主要細(xì)胞類型 (>10% of each main non-CM cells including EC, FB, MP and T cells，也就是去掉了中性粒)
(2) 在上面選出的四個(gè)大類的非心肌細(xì)胞群中瘟檩，F(xiàn)B包括9個(gè)亞群抹缕，EC包括9個(gè)亞群，MP包括6個(gè)亞群墨辛，T細(xì)胞的分群沒(méi)有看到卓研？。作者計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞亞群在相鄰時(shí)間點(diǎn)變化的logFC睹簇，取了logFC絕對(duì)值最大的top 50%細(xì)胞群奏赘。這些細(xì)胞群根據(jù)比例上調(diào)還是下調(diào)被分為up和down細(xì)胞群。
(3) 隨后作者使用Seurat的FindAllMarkers找了每個(gè)群的marker基因(q value < 1e-3)太惠，和genes encoding secreted protein基因集取交集磨淌，講得到的基因作為possible ligands。方法見(jiàn)：分泌蛋白基因列表下載凿渊。
(4) 為了保證這些ligands是在特意性在up/down細(xì)胞群里表達(dá)的梁只，基因再次被過(guò)濾缚柳。標(biāo)準(zhǔn)是這個(gè)基因在一個(gè)群里的表達(dá)是在其他組表達(dá)的4倍以上。
(5) 對(duì)得到的所有g(shù)ene做了GO和KEGG分析
(6) 和心肌擬時(shí)序得到的擬時(shí)差異基因和通路取交集搪锣，得到的通路和基因使用network包秋忙，sna包和GGally包繪制了如下的網(wǎng)絡(luò)圖
真的復(fù)雜...不愧是于老師...
Supplemental Fig 8E：篩選出來(lái)的基因和通路的網(wǎng)絡(luò)圖
Supplemental Fig 8F：篩選出來(lái)的由非心肌表達(dá)且和心肌相關(guān)ligands基因主要在FB5表達(dá)，提示這個(gè)細(xì)胞群可能潛在的影響心肌細(xì)胞的biological behaviors构舟。
Supplemental Fig 8G：計(jì)算了上述基因在不同細(xì)胞群的sum of cell average expression灰追，F(xiàn)B5最高
Supplemental Fig 8H：細(xì)胞群間的互作提示decreased interactions with FB5 was the most pronounced alterations in this transition。
小結(jié)：These observations suggested loss of protective factors from fibroblasts highly correlated to hypertrophy initiation.
5. Activation of Proinflammatory Macrophages Is the Key Event in the Transition From Normal to Reduced EF
分析完0-2周的變化狗超，下一步是做2-5這個(gè)時(shí)間段的變化弹澎，思路和做法與前一部分一致。
Fig 4A-C：2-5周心肌細(xì)胞擬時(shí)序基因富集到immune re- sponse, response to cytokine and chemokine等通路抡谐，提示這個(gè)階段有炎癥反應(yīng)參與其中裁奇。
Fig 4D：2-5周的時(shí)候，比例出現(xiàn)顯著變化的非心肌
Fig 4E：2-5周心肌擬時(shí)相關(guān)基因和非心肌ligand基因取交集得到的基因富集到了很明顯的炎癥反應(yīng)相關(guān)通路
Fig 4F：巨噬細(xì)胞明顯活化麦撵，表達(dá)促炎性marker比如Lgals3刽肠。
Fig 4G：計(jì)算了上述基因在不同細(xì)胞群的sum of cell average expression，MP4和MP0都很高免胃。
Fig 4H：免疫組化檢測(cè)LGALS3音五，結(jié)果顯示在5周心臟出現(xiàn)明顯表達(dá)增強(qiáng)，提示巨噬細(xì)胞活化羔沙。
Fig 4G：免疫熒光檢測(cè)2-5周心臟TNNT2, CD68, FAS的表達(dá)躺涝，結(jié)果提示巨噬細(xì)胞活化。
隨后作者對(duì)這部分的結(jié)果進(jìn)行了更進(jìn)一步的驗(yàn)證
Fig 5A B：和2w相比扼雏，5周小鼠心臟MP4巨噬細(xì)胞的marker. CD68和PDGFRA出現(xiàn)明顯高表達(dá)
Fig 5C：MP4和心肌細(xì)胞間的其他互作配體受體對(duì)
Fig 5D：免疫熒光驗(yàn)證Fig 5C
Fig 5E：2-5周期間altered cell-cell interaction坚嗜，MP0和MP4處在一個(gè)比較核心的地方，supporting the hypothesis that macrophage subtype switching was a key event underlying the progression of pathological cardiac hypertrophy during 2 weeks to 5 weeks
Fig 5F：提取正常/5w心臟中的巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)诗充，和5w巨噬共培養(yǎng)的心肌出現(xiàn)了明顯的肥厚相關(guān)基因如Nppa 和Nppb的高表達(dá)苍蔬。
小結(jié)：Together, our findings suggested a pivotal role of mac- rophage subtype switching toward an inflammatory state in the reduction of cardiac function during patho- logical cardiac hypertrophy.
6. Fibroblast and Endothelial Cell Subtypes Highly Correlate to Disease Progression at Late Stage of Pathological Cardiac Hypertrophy
和前面兩部分一樣的思路分析了5-11周的心肌發(fā)育軌跡和與非心肌的互作
5-11周主要是內(nèi)皮和成纖維在起作用，主要參與了ECM remodeling等過(guò)程
7. Stage-Specific Pharmacological Inhibition of Macrophage Subtype Switching Attenuates Pathological Cardiac Hypertrophy
在肥厚發(fā)生過(guò)程中蝴蜓，從EF正常到EF異常（2-5w）是一個(gè)關(guān)鍵的時(shí)間點(diǎn)碟绑。前面的分析提示巨噬細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程發(fā)揮了重要作用，所以作者使用了抗炎藥dapagliflozin(達(dá)格列凈)在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行治療茎匠，看是否可以起到抑制肥厚的發(fā)生格仲。為了更好的證明結(jié)論，作者同時(shí)也使用了另外兩個(gè)藥TD139和arglabin诵冒，并設(shè)置了0-2周給藥組進(jìn)行治療凯肋。
Fig 6A B：給藥流程
Fig 6C D：0-2周給藥和2-5周給藥的小鼠心功能∑觯可以看到 侮东，0-2周給藥小鼠不能逆轉(zhuǎn)心功能下降午笛，但0-5周給藥小鼠5-8周時(shí)心功能明顯好于未給藥組。
Fig 6E F：2-5周給藥可以改善小鼠心臟肥大苗桂，減輕纖維化
Fig 6G H：活化的促炎巨噬細(xì)胞 可以表達(dá)LGALS3。2-5周給藥可以顯著降低LGALS3的表達(dá)告组，0-2周給藥則不行 煤伟。
Fig 6I-M：2-5周給藥后，促炎因子CCL6和CCL24木缝，促肥厚因子NPPA和NPPB的表達(dá)也被明顯抑制便锨。
小結(jié)：Together, these results demonstrated the effectiveness of stage-specific targeting of macrophage in suppressing pathological cardiac hypertrophy, underscoring the importance of precise intervention in disease progression.
8. Hypertrophy-Related Transcriptomic Alterations Are Conserved in Human Samples
前面的實(shí)驗(yàn)都是在小鼠上做的，為了驗(yàn)證患者是否也有類似的表現(xiàn)我碟，作者對(duì)8個(gè)正常對(duì)照放案，7個(gè)肥心患者心臟樣本，7個(gè)心衰樣本進(jìn)行了 bulk RNAseq矫俺。
Fig 7A B：人類心臟樣本中的巨噬細(xì)胞ligand基因的火山圖和熱圖
Fig 7C：MP中上調(diào)的基因和HCM患者的up genes顯著富集吱殉，提示人和小鼠具有一致性
Fig 7D-H：小鼠和人的內(nèi)皮和成纖維基因表達(dá)一致性也比較好
Fig 7I：整個(gè)文章的總結(jié)圖
參考文獻(xiàn)：
- Briggs JA, Weinreb C, Wagner DE, Megason S, Peshkin L, Kirschner MW and Klein AM. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 2018;360.
