作者：堯小飛
審稿：童蒙
編輯：amethyst

01 背景介紹

目前在NGS的科技服務(wù)市場上單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和三代是最火的兩個方向食拜，也是由于工業(yè)技術(shù)升級帶來的研究的新方向和新視野（單細(xì)胞分篩技術(shù)和單分子全長測序）簿训。單細(xì)胞技術(shù)為我們研究細(xì)胞的異質(zhì)性、細(xì)胞發(fā)育袜漩、腫瘤微環(huán)境、精準(zhǔn)醫(yī)療帶來了巨大的進(jìn)步，大大促進(jìn)了研究從混合細(xì)胞到單細(xì)胞的水平的進(jìn)步，進(jìn)一步揭示了生物體的微觀視野的變化規(guī)律只恨。單分子全長能夠在不打斷的前提下直接測mRNA或者DNA全長序列译仗，避免了短序列的拼接可能出現(xiàn)的錯誤抬虽，發(fā)現(xiàn)了大量之前未發(fā)現(xiàn)的新的轉(zhuǎn)錄本。

那么有沒有辦法能夠?qū)烧叩募夹g(shù)結(jié)合起來纵菌，在單細(xì)胞層面研究其全長轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律阐污？答案是肯定的，早在2018年10月的時候Ishaan等人就在Nature Biotechnology（https://www.nature.com/nbt）上發(fā)表了單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組的研究方法咱圆，作者主要是利用10xGenomics公司的單細(xì)胞分篩平臺笛辟，得到單個細(xì)胞的全長cDNA文庫，然后用Pacbio平臺的建庫技術(shù)進(jìn)行三代建庫序苏，然后測得單個細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄本手幢，通過研究不同亞群細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本特征，發(fā)現(xiàn)了亞群特異的轉(zhuǎn)錄本忱详，這從另外一個視野研究了細(xì)胞的異質(zhì)性围来。

雖然上面解決了沒有單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄本的問題，但是Ishaan等人的方法將會具有一個巨大的成本問題匈睁，三代和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組本來成本就有些較高监透，兩者結(jié)合起來，如果還要用三代定量的話航唆，一個樣品初步預(yù)計也得快20萬了胀蛮，因此此方案不太適合推廣。雖然目前三代供應(yīng)商Pacbio和ONT都有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組解決方法糯钙，但都有面對成本的問題粪狼，因此亟需一個低成本的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄本或者類似的方案。

Rickard團(tuán)隊是單細(xì)胞領(lǐng)域中鼎鼎大名的團(tuán)隊任岸，在10xGenomics平臺問世之前再榄，他們團(tuán)隊開發(fā)的smart-seq是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域中絕對的王者。時隔7年演闭，2020年5月6日不跟，Rickard團(tuán)隊在smart-seq2的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)開發(fā)了smart-seq3技術(shù)（Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3）（https://www.nature.com/articles/s41587-020-0497-0）米碰，該技術(shù)就是低成本的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組的解決方案窝革，并將該技術(shù)發(fā)表在Nature Biotechnology 购城。

02 Smart-seq3建庫基本原理

Smart-seq3既然號稱能夠在轉(zhuǎn)錄本水平研究單細(xì)胞的異質(zhì)性，那么它究竟是如何達(dá)到的呢虐译？我們首先看看其建庫原理瘪板。原理圖如下：

從上面的建庫原理圖來看，其建庫方式基本上與smart-seq2一致漆诽，最大的不同在于在Tn5酶的tag后面添加了UMI序列（上圖中的紅色x號表示轉(zhuǎn)錄本的突變位點）侮攀，其建庫流程如下：

1. 通過oligo-dT priming釣取含有polyA尾巴的mRNA。
2. 通過TSO(template-switching oligo)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄厢拭，合成全長cDNA文庫兰英，得到A1序列。TOS序列構(gòu)成：Tn5 motif 11 and a novel 11-bp tag sequence, followed by an 8-bp UMI sequence and three riboguanosines.
3. 通過PCR擴(kuò)增供鸠，將A1序列進(jìn)行擴(kuò)增畦贸，擴(kuò)增多條序列。
4. tagmentation楞捂，通過Tn5-based進(jìn)行tagmentation薄坏，然后構(gòu)建測序上機(jī)文庫。
5. 通過UMI序列區(qū)分是否是internal reads寨闹，挑選5‘帶有UMI序列胶坠，構(gòu)建延伸轉(zhuǎn)錄本。

在構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組的過程中繁堡，主要是挑選5’UMI序列的雙端序列進(jìn)行構(gòu)建沈善；由于5‘都是一樣的，但是3’不一樣（綠色的條塊）帖蔓，因此可以將具有相同的5‘端的序列矮瘟，不同3’的序列進(jìn)行合并，延伸轉(zhuǎn)錄本塑娇，得到更長的轉(zhuǎn)錄本澈侠。這種方式得到的轉(zhuǎn)錄本當(dāng)然沒有Pacbio等三大方法得到的全長轉(zhuǎn)錄本長、全埋酬，但是相對于普通單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來說哨啃，轉(zhuǎn)錄本長度大大增加了，提供了單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組的特征写妥。下圖為Smart-seq3文庫長度分布（其文庫長度分布在600-2000bp之間）：

03 Smart-seq3與 PacBio 結(jié)果比較

既然smart-seq3是為了達(dá)到轉(zhuǎn)錄組水平開發(fā)的技術(shù)拳球，那就需要比較一下它與真正的三代技術(shù)具體有什么差異，到底有什么區(qū)別珍特？作者構(gòu)建了369 individual primary mouse fibroblasts ( F1 offspring from CAST/EiJ and C57/Bl6J strains ) 文庫祝峻，然后構(gòu)建全長轉(zhuǎn)錄本，并且同時使用smart-seq3構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行Pacbio建庫，建庫用的是SMRTbell Template Prep Kit 1.0-SPv3試劑盒莱找，可以構(gòu)建500–2,000 bp的文庫酬姆， Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated from raw reads using the SMRTlink pipeline。

Smart-seq3文庫長度分布

注：Summarizing the numbers of RNA molecules (x axis, log 10 ) reconstructed to different lengths (in base pairs, y axis), showing only molecules additionally assigned to a unique transcript isoform. In total, the 1 million longest reconstructed RNA molecules are shown from one experiment with 369 mouse fibroblasts, with molecules shown in descending order.

上表格展示了Smart-seq3的轉(zhuǎn)錄本長度和數(shù)目分布的數(shù)據(jù)奥溺，從上圖可以看出辞色，smart-seq3可以構(gòu)建較長的轉(zhuǎn)錄本，可以從轉(zhuǎn)錄組水平上研究單細(xì)胞的異質(zhì)性浮定。與PacBio的數(shù)據(jù)相比相满， 有54,302 RNA分子在smart-seq3和Pacbio兩種平臺都能檢出；smart-seq3檢出的全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)目占Pacbio的 46% 桦卒。如下圖a所示立美。

具體就 Col1a2基因來說，該轉(zhuǎn)錄本長度為2.3kb闸盔， Smart-seq3構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本長度為1.9 kb悯辙，Pacbio的轉(zhuǎn)錄本長度為2.267kb琳省。

04 Smart-seq3其他方面的優(yōu)勢

今天在這里主要介紹了Smart-seq3構(gòu)建全長轉(zhuǎn)錄本的特點迎吵，沒有對其他的優(yōu)點進(jìn)行詳細(xì)介紹，如果對此感興趣针贬，可以翻一翻原文击费。其實Smart-seq3在Smart-seq2的基礎(chǔ)上有較大的技術(shù)改進(jìn)和提示，比如另外一個比較重要的方面就是SNP分型的問題桦他，比如做測試的 CAST and C57 alleles蔫巩，Smart-seq3的結(jié)果較Smart-seq2的結(jié)果相關(guān)性有顯著性的提高，由之前的 0.79和0.68提升到了0.94和0.75快压。

CAST and C57 alleles相關(guān)性結(jié)果圖

另外Smart-seq3的基因檢出較Smart-seq2有顯著性的提高圆仔，而且編碼蛋白、lncRNA檢出也有較高的提高蔫劣。

編碼蛋白坪郭、lncRNA基因檢出結(jié)果

05 總結(jié)

總而言之，Smart-seq3與Smart-seq2相比較脉幢，無論是在基因分型歪沃、轉(zhuǎn)錄本長度、編碼基因和lncRNA基因的檢出數(shù)來說嫌松，都具有了較大的提升沪曙。特別是Smart-seq3可以構(gòu)建全長轉(zhuǎn)錄本，讓研究者可以研究單細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)錄本特性萎羔，雖然轉(zhuǎn)錄本檢出只有Pacbio的46%液走，但是其優(yōu)點在于可以在較低的成本情況下，研究單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄本特征。

目前單細(xì)胞水平的全長轉(zhuǎn)錄本解決方案較多缘眶，比如Pacbio和ONT都推出了相應(yīng)的解決方案腻窒，但是三代+單細(xì)胞的方案難以企及的成本，影響了其推廣應(yīng)用磅崭；Smart-seq3在一定程度上的解決了此問題儿子，可以在目前進(jìn)行推廣應(yīng)用；當(dāng)然如果用Smart-seq3+三代的話砸喻，其構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄本將會更完整柔逼。

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