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重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）宇驾，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)（由英國公司TwistDx Inc開發(fā)）击奶。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp? 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品淀零，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測秧廉。RPA的擴(kuò)增引物可以說是整個反應(yīng)的關(guān)鍵所在，那么怎樣才能設(shè)計好RPA引物呢汁果？
生物通報道：重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification涡拘，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)（由英國公司TwistDx Inc開發(fā)）据德。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp? 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品鳄乏，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低晋控，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)赡译、食品安全仲吏、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域蝌焚。
RPA的擴(kuò)增引物可以說是整個反應(yīng)的關(guān)鍵所在裹唆，那么怎樣才能設(shè)計好RPA引物呢？（延伸閱讀：替代PCR只洒，RPA在HIV檢測中大展身手）
引物長度的選擇
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RPA引物的長度一般為30至35個核苷酸许帐，引物過短會嚴(yán)重影響重組酶的活性。長引物實際上是可以使用的毕谴，比如45個核苷酸的引物就曾成功用于RPA擴(kuò)增成畦。不過，長引物并不一定能提高擴(kuò)增性能涝开，反而還會增加形成二級結(jié)構(gòu)的可能性循帐，增大來自引物的噪音。為此舀武，TwistDx公司建議大家不要設(shè)計過長的引物拄养。
引物的序列要求
RPA引物還沒有一個確定的序列設(shè)計規(guī)則，不過這里有一些現(xiàn)成的經(jīng)驗可供參考：
5’端的3-5個核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥嘌呤银舱，胞嘧啶在這里是有益的瘪匿，能促進(jìn)片段的重組跛梗。對于3’末端的3個核苷酸來說，鳥嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合棋弥，可以提升引物的擴(kuò)增性能核偿。引物中最好不要出現(xiàn)特殊序列，比如長串的聚嘌呤或聚嘧啶顽染。GC含量過高（>70%）或過低（<30%）都不利于RPA擴(kuò)增宪祥。此外，引物設(shè)計時應(yīng)當(dāng)盡量避免容易形成二級結(jié)構(gòu)家乘、引物-引物互作、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列藏澳，減少引物二聚體的形成仁锯。
擴(kuò)增產(chǎn)物的長度限制
RPA可以擴(kuò)增長達(dá)1.5kb的DNA產(chǎn)物，不過這取決于反應(yīng)的條件翔悠。標(biāo)準(zhǔn)TwistAmp試劑盒針對反應(yīng)速度進(jìn)行了優(yōu)化业崖，目前只適合擴(kuò)增不超過500bp的擴(kuò)增子，對100-200bp的擴(kuò)增子效果最佳蓄愁。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的下限主要由RPA引物所決定双炕，通常擴(kuò)增產(chǎn)物要超過70-80bp。
如果需要用到檢測探針撮抓，那么在設(shè)計擴(kuò)增引物時應(yīng)該留下足夠的空間妇斤。
引物篩選的主要流程
目前我們還不能僅根據(jù)序列判斷引物的擴(kuò)增性能，因此需要對候選引物進(jìn)行測試和篩選丹拯。RPA的引物篩選主要分為以下幾步：選擇靶標(biāo)區(qū)域站超，設(shè)計候選引物，篩選候選引物乖酬，提升性能再次篩選死相。（更多信息參見TwistDx官網(wǎng)：http://www.twistdx.co.uk/）
需要注意的是，靶標(biāo)區(qū)域應(yīng)選擇核苷酸組成相對“平均”的模板序列咬像。GC含量最好在40%到60%之間算撮，不含長串的聚嘌呤或聚嘧啶，盡量不含正/反向重復(fù)和回文序列等等县昂。靶標(biāo)區(qū)域最好避開基因組中的重復(fù)元件肮柜。
