設(shè)計(jì)引物
引物長(zhǎng)度一般在15~30 bp，最常用的是18~27bp汗捡；
引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好在72℃左右。Tm值簡(jiǎn)單粗暴的計(jì)算方法為Tm=4×(G+C)+2×(A+T)蒙兰，或在此基礎(chǔ)上減5℃磷瘤；
引物3’端不能選擇A，最好選擇T搜变，G/C的錯(cuò)配率介于A/T之間采缚；
以上為最主要的原則，另外還要注意引物的特異性挠他、引物內(nèi)部不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)等原則扳抽，具體可以百度之；
CDS的獲取
獲取一個(gè)基因CDS序列的方法如下：
打開NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）殖侵，如下圖贸呢，按照順序，在1處選擇Nucleotide愉耙，在2處輸入“PDCD1”贮尉，點(diǎn)擊3處的Search，等出來(lái)結(jié)果之后點(diǎn)擊4處的“Homo Sapiens”進(jìn)行進(jìn)一步篩選（如果你要做鼠源的就選Mus musculus朴沿，其他種屬選擇相應(yīng)的名稱即可進(jìn)一步篩選了）
然后第一條就是我們需要的序列信息猜谚，點(diǎn)擊進(jìn)去，往下拉赌渣，直到看到CDS（如下圖）
點(diǎn)擊CDS魏铅，就出現(xiàn)了下圖中所示內(nèi)容，其中加了底色的部分序列便是我們需要的序列了坚芜，可以看到這段序列開頭是ATG起始密碼子览芳，最后三位是TGA終止密碼子。選中這段序列復(fù)制即可鸿竖。
由于需要PCR整個(gè)CDS區(qū)域沧竟，所以正反向引物并沒有多少選擇的余地，甚至可以參照上述原則簡(jiǎn)單粗暴的從正反向各選擇22個(gè)堿基左右作為引物缚忧，例如：!
正向引物序列與CDS相同悟泵，反向引物序列與CDS互補(bǔ)。另外要注意的是寫引物等序列都是要5’到3’的方向闪水，一般不會(huì)從3’到5’糕非，所以我們的CDS雖然沒有注明方向，但是其實(shí)也是5’到3’球榆。
雖然可以這么簡(jiǎn)單粗暴的設(shè)計(jì)引物朽肥，但是還是想借此教大家使用一下引物設(shè)計(jì)的經(jīng)典軟件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下圖持钉，首先點(diǎn)擊File->New->DNA Sequence衡招，
然后點(diǎn)擊空白處Ctrl+V粘貼我們的CDS序列，選擇As is右钾，即我們復(fù)制的是什么樣的序列就粘貼的什么樣的序列蚁吝。
下面的依次是“反向序列粘貼”旱爆、“互補(bǔ)序列粘貼”“反向互補(bǔ)序列粘貼”舀射。
點(diǎn)擊左上角的Primer窘茁，如下圖，S=Sense脆烟，A=Antisense
如果對(duì)現(xiàn)在的引物不滿意山林，還可以點(diǎn)擊Edit Primers編輯序列，如下圖邢羔，我們刪除掉末尾三個(gè)堿基驼抹，之后需要先點(diǎn)擊Analyse，然后才能點(diǎn)擊OK拜鹤，我們可以看到正向引物已經(jīng)從25個(gè)堿基變?yōu)?2個(gè)堿基了框冀。
最后點(diǎn)擊Edit->Copy->Sense Primer，粘貼到Word中即可得到正向引物敏簿，反向引物Copy之后粘貼也會(huì)自動(dòng)變?yōu)?’到3’的序列明也。所以非常方便。
這樣我們PDCD1用于PCR的正反向引物就初步設(shè)計(jì)好了惯裕。如果你只是想P出PDCD1這個(gè)基因温数，現(xiàn)在的引物就可以送去合成了，但是如果你想將其構(gòu)建到載體上蜻势，那么我們還要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的加工撑刺。
Primer 5的使用
根據(jù)不同的目的，可以選擇不同的載體握玛，如過(guò)表達(dá)（pcDNA 3.0）够傍、敲減（pLKO.1-TRC）、原核純化（pGEX-4T1挠铲、pET-28a）冕屯、病毒包裝（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等市殷。下面我們就以過(guò)表達(dá)載體pcDNA 3.0為例進(jìn)行講解愕撰。
從質(zhì)粒圖譜上可以看到多克隆位點(diǎn)有多個(gè)酶切位點(diǎn)可以選擇，那是不是每個(gè)位點(diǎn)都可以用呢醋寝？當(dāng)然不是搞挣！我們要選擇那些PDCD1（或其他目的基因）本身沒有的酶切位點(diǎn)！
所以我們還需要用Primer 5來(lái)分析一下哪些是PDCD1所沒有的音羞。
還是打開Primer 5囱桨，然后粘貼CDS序列，點(diǎn)擊Enzyme嗅绰，2為所有的酶舍肠，我們比對(duì)質(zhì)粒圖譜選擇多克隆位點(diǎn)的酶搀继，雙擊即可到3的框中，選好之后點(diǎn)擊OK翠语，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI兩個(gè)酶切位點(diǎn)叽躯，所以這兩個(gè)不可以選，其他的都可以選肌括。
不過(guò)一般選擇常用好用的最好是實(shí)驗(yàn)室就有現(xiàn)成的那些酶了点骑。比如我們選擇EcoRI和XhoI，那么我們就可以在對(duì)引物加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)了谍夭。
于是我們得到如下引物：
好了黑滴，我們現(xiàn)在就可以將這些引物送去相應(yīng)公司合成了。
質(zhì)粒構(gòu)建
終于到正題了紧索！
待引物合成之后袁辈，我們用ddH2O將其稀釋到100 μM作為母液，取一些稀釋到10 μM做下一步實(shí)驗(yàn)了珠漂。
首先我們P出目的基因晚缩，這一步建議用高保真PCR酶，小編常用的是Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶甘磨。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下圖：
模板的獲取
找到表達(dá)（最好高表達(dá)）該基因的細(xì)胞或者組織橡羞，用TRIzol法抽提RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到相應(yīng)的cDNA作為模板济舆；
免費(fèi)索取卿泽。給大家推薦一個(gè)可以免費(fèi)索取cDNA的地址：http://hanlab.xmu.edu.cn。韓家淮院士為大家免費(fèi)提供cDNA滋觉，只需要進(jìn)入該網(wǎng)址點(diǎn)擊左側(cè)導(dǎo)航欄的“****cDNA索取”即可免費(fèi)獲取韓家淮院士實(shí)驗(yàn)室的cDNA了签夭！
PCR完成之后跑1%的膠回收目的片段，也可以直接用PCR Clean試劑盒回收椎侠〉谧猓回收之后將其雙酶切，同時(shí)需要酶切適量載體我纪。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶慎宾，還可以打開網(wǎng)址http://t.cn/RVuwBVo查詢雙酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段進(jìn)行連接浅悉，小編使用的是Thermo公司的T4連接酶趟据，體系如下：
現(xiàn)在的T4連接酶基本都是快酶，比如Thermo的這款聲稱10 min就可以連接完成术健，不過(guò)小編保險(xiǎn)起見汹碱，一般連接30 min，切勿連接過(guò)夜荞估！
連接完成之后便是轉(zhuǎn)化咳促，挑菌（單克轮尚隆），搖菌抽提質(zhì)粒跪腹，送去測(cè)序就OK了褂删！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比較成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比較穩(wěn)定且廣泛應(yīng)用的尺迂，當(dāng)然現(xiàn)在一些國(guó)產(chǎn)的TRIzol類產(chǎn)品也能滿足大部分情況下的RNA抽提笤妙。
ABOUT TRIzol
注意事項(xiàng)及原理
注意事項(xiàng)：
1冒掌、RNA酶（RNase）非常穩(wěn)定噪裕，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活股毫，但限制因素去除后又會(huì)迅速?gòu)?fù)性膳音。用常規(guī)的高溫高壓蒸汽滅菌法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上铃诬，因此祭陷，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套趣席。RNase的又一污染源是取液器兵志，一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部。提取RNA時(shí)使用專門的RNase-free的槍頭和離心管宣肚。
2想罕、TRIzol試劑具有較強(qiáng)毒性，如沾到皮膚立刻用大量的清潔劑和水沖洗霉涨！
溶液配方及原理：
1按价、TRIzol試劑：TRIzol能在破碎細(xì)胞、溶解細(xì)胞內(nèi)含物的同時(shí)保持RNA的完整笙瑟。其主要成分是苯酚和異硫氰酸胍楼镐。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白往枷、核酸物質(zhì)解聚得到釋放框产。異硫氰酸胍，是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑错洁，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失秉宿，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離墓臭。
2蘸鲸、氯仿：氯仿可增強(qiáng)TRIzol中的8-羥基喹啉對(duì)RNase的抑制作用。另外氯仿作為有機(jī)溶劑窿锉，加入氯仿后離心可使溶液分層酌摇，上層為水相膝舅，下層為有機(jī)相。苯酚為弱酸性窑多，酸性條件下（一般為Ph5.0）DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相仍稀，而RNA留在水相；反之亦然埂息，弱堿性（Ph8.0）時(shí)DNA留在水相技潘。
3、異丙醇千康、無(wú)水乙醇享幽、70%乙醇：異丙醇和乙醇能與水任意比例互溶，因此加入異丙醇能夠奪取RNA周圍的水分拾弃，使其脫水沉淀值桩。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化學(xué)修飾劑豪椿，它與RNase的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制其活性奔坟。DEPC有毒性，操作時(shí)應(yīng)小心搭盾。誰(shuí)說(shuō)是最優(yōu)秀的咳秉；誰(shuí)是最自由的，誰(shuí)也就是最優(yōu)秀的鸯隅，在他們身上澜建，才會(huì)有最大的美。
操作步驟
1滋迈、細(xì)胞破碎
A霎奢、組織：按1 mL/50~100 mg組織樣品的比例向打散的組織塊中加入TRIzol試劑，樣品的體積不能超過(guò)TRIzol體積的10%饼灿。
B幕侠、貼壁細(xì)胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol試劑，并用移液槍反復(fù)吹吸數(shù)次碍彭。TRIzol試劑過(guò)少會(huì)導(dǎo)致DNA污染晤硕。
C、懸浮細(xì)胞：懸浮細(xì)胞離心收集后庇忌，直接按1 mL/5~10×106個(gè)細(xì)胞（動(dòng)物舞箍、植物或酵母）的比例加入TRIzol試劑。加入TRIzol前不要洗細(xì)胞皆疹，否則易造成mRNA的降解疏橄。
如果樣品中含有較多的蛋白、脂肪、多糖或其他細(xì)胞外物質(zhì)捎迫，如肌肉晃酒、脂肪組織或植物的塊根等，可在2℃~8℃窄绒，12000×g離心10 min去除這些物質(zhì)贝次。
關(guān)于TRIzol的用量，Invitrogen官方說(shuō)明書中有建議用量：
一般情況下彰导，根據(jù)細(xì)胞量的多少小編的用量是：2~3 mL/10 cm Dish蛔翅、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（僅供參考）
2位谋、氯仿抽提分層
加入TRIzol后山析，室溫（15℃~30℃）孵育5 min保證核蛋白復(fù)合體充分解離。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿倔幼。蓋緊管蓋后劇烈搖晃15s盖腿，室溫靜置23分鐘。12000×g损同，2℃8℃離心10 min，轉(zhuǎn)速不可過(guò)高否則會(huì)導(dǎo)致RNA斷裂鸟款。離心后液體分為三層膏燃，下層為紅色的有機(jī)相（酚-氯仿），中間為白色的沉淀何什，上層為無(wú)色的水相组哩。RNA在上層水相中，水相的體積約為加入的TRIzol體積的60%处渣。
3伶贰、用異丙醇使RNA沉淀
將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白質(zhì)就保存下層有機(jī)相罐栈。
加入與水相等體積的異丙醇黍衙，室溫孵育10 min。12000×g荠诬，2℃~8℃離心10 min琅翻。RNA沉淀一般附著在遠(yuǎn)離離心機(jī)軸心的管底，為無(wú)色膠狀柑贞。
4方椎、用乙醇洗滌去除殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗滌RNA沉淀钧嘶。震蕩混勻RNA后棠众，7500×g 2℃~8℃離心5 min。
5有决、用DEPC水溶解RNA
去除上清后闸拿，將管子敞口晾5~10 min轿亮，使RNA沉淀呈現(xiàn)半透明狀。不要讓RNA沉淀變成完全不透明胸墙，那時(shí)RNA完全干燥將會(huì)大大影響RNA的溶解我注。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求加入適量的DEPC水，用移液槍反復(fù)吹吸數(shù)次后迟隅。
逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA
一般逆轉(zhuǎn)錄（也可稱作反轉(zhuǎn)錄）都有現(xiàn)成的試劑盒但骨，只要大家按照試劑盒的說(shuō)明書來(lái)操作，問題都不大智袭，在這里小編就以TAKARA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為例稍加說(shuō)明奔缠。
Random 6 mers為隨機(jī)的6核苷酸引物吼野，引物序列為5'-(P)NNNNNN-3'，特點(diǎn)是產(chǎn)物量大闷哆，特異性差，適用于長(zhǎng)的或具有Hairpin構(gòu)造的RNA单起。包括rRNA、mRNA屈留、tRNA等在內(nèi)的所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都可使用本引物。
Oligo dT Primer適用于具有Poly（A）Tail的RNA测蘑，因而特異性好，但因其只結(jié)合Poly A尾巴碳胳，對(duì)于較長(zhǎng)的mRNA固逗，經(jīng)常不能延伸到5'端烫罩。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA盗誊、tRNA以及某些種類真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
兩種引物可據(jù)實(shí)際情況使用一種，也可同時(shí)使用开镣。還有一種情況邪财，當(dāng)只擴(kuò)增一種目的基因時(shí)树埠，也可以使用Specific Primer（PCR時(shí)的下游引物）作為反轉(zhuǎn)錄引物。
操作步驟
步驟簡(jiǎn)述如下：按照下圖中1配制溶液又碌，然后65℃處理后加入3中所配制溶液繼續(xù)后續(xù)反應(yīng)即可毕匀。
連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
常用的感受態(tài)細(xì)胞有DH5α期揪、BL21（DE3）、Rossetta等姓建，而抽提質(zhì)粒一般用DH5α速兔，可以自己制備也可以購(gòu)買商業(yè)化的感受態(tài)涣狗。
ABOUT Transformation
注意事項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞要現(xiàn)用現(xiàn)融，剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)轉(zhuǎn)化效率最高穗熬；
2. 避免反復(fù)凍融感受態(tài)細(xì)胞唤蔗；
3. 整個(gè)操作過(guò)程要輕柔，不要用移液器猛烈吹吸箱季；
4. 感受態(tài)和連接產(chǎn)物（或質(zhì)粒）用量要適中藏雏，并不是越多越好掘殴。
操作步驟
1. 取50 μL感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化最疆；
2. 加入5 μL連接產(chǎn)物（質(zhì)粒一般只需用白色槍頭沾取一下即可）努酸，混勻获诈，置于冰上靜置30 min（此時(shí)應(yīng)該打開水浴鍋并調(diào)溫至42℃）；
3. 42℃水浴中熱激90 s笼踩，迅速置于冰上靜置2 min嚎于；
4. 加入500 μL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基（不含抗生素）挟冠，混勻后置于37℃知染，200rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1 h控淡，使細(xì)胞復(fù)蘇；
5. 連接產(chǎn)物：3000 rpm離心5 min辫诅，棄上清泥栖，留取少量LB（50 μL左右）吧享，重懸沉淀，全部均勻涂布于LB培養(yǎng)板（需含相應(yīng)抗生素）上钞它，37℃ 倒置培養(yǎng) 1618h遭垛；質(zhì)粒：直接取2050 μL涂于LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)即可锯仪。
質(zhì)粒的小量提取
ABOUT 質(zhì)粒抽提
實(shí)驗(yàn)原理：
較常用的質(zhì)粒提取方法有三種：堿裂解法趾盐、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法救鲤。前兩種方法比較劇烈本缠，適用于較小的質(zhì)粒（<15kb）丹锹。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒（>15kb）峻村。
堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒的方法，其原理為：當(dāng)細(xì)菌暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中窜锯，會(huì)使細(xì)胞壁破裂锚扎，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性驾孔，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。
由于質(zhì)粒DNA分子比染色體DNA大得多妖啥，且前者為共價(jià)閉合環(huán)狀分子荆虱，后者為線狀分子怀读。只要堿處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過(guò)菜枷，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)叁丧，質(zhì)粒DNA雙鏈就會(huì)再次形成歹袁。
在裂解過(guò)程中条舔，細(xì)菌蛋白質(zhì)孟抗、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)互相纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽（SDS）包蓋铅协。
當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)狐史，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)骏全。離心除去沉淀之后姜贡，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA楼咳。
本方法采用Tiangen小提中量試劑盒進(jìn)行提取，其純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料余耽，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上宾添，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除俄讹，最后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來(lái)剑鞍。得到的質(zhì)潦弑溃可以用于酶切沥阳、PCR桐罕、測(cè)序功炮、細(xì)菌轉(zhuǎn)化术唬、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)粗仓。
實(shí)驗(yàn)試劑（試劑盒試劑配方不清楚借浊，以下配方見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》）
1巴碗、溶液P1：50 mM葡萄糖橡淆，25 mM Tris-Cl（pH 8.0）逸爵，10 mM EDTA师倔，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一個(gè)合適的緩沖體系；50 mM葡萄糖可以使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部疲恢；而EDTA 作為Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑显拳，起到了抑制DNase的作用杂数；RNase作用為去除質(zhì)粒中混有的RNA揍移，其不受EDTA的影響那伐。
2喧锦、溶液P2：0.2 N NaOH燃少，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使細(xì)菌裂解阵具，而SDS作用在于加入P3之后是被其包蓋的細(xì)菌蛋白阳液，染色體DNA一起作為沉淀析出帘皿。
3畸陡、溶液P3：3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸
原理：這一步的K+置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na+斋日，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀恶守；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合兔港，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子押框，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了橡伞，同時(shí)染色體DNA也被PDS共沉淀兑徘。而醋酸用于中和堿挂脑，使溶液恢復(fù)中性崭闲，從而使質(zhì)粒DNA復(fù)性刁俭。
操作步驟
1、將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液（5-15ml）從搖床中取出如孝，并擰緊蓋子第晰，9000 rpm離心10 min，用泵盡量吸除上清罗岖。若暫時(shí)不提取，可將沉淀保存于-20℃纺非，也可直接將菌液保存于4℃（短時(shí)間）。
注意：如果菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中炕淮。
2跳夭、柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）離心1 min润歉，倒掉收集管中的廢液踩衩，將吸附柱重新放回收集管中（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）驱富。
注意：若柱子放置較久褐鸥，需要進(jìn)行這一步驟晶疼；否則翠霍，可省寒匙。
3锄弱、向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA会宪，并置于冰上 ) 掸鹅，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀巍沙，并移至2ml離心管中句携。如果沉淀的菌體較多矮嫉，則相應(yīng)增加P1的用量（之后P2和P3的用量也應(yīng)成比例增加）敞临，并分到幾個(gè)管子中分別進(jìn)行步驟4和5的操作（不然P1+P2+P3的總體積超過(guò)2ml離心管容積）挺尿，步驟6過(guò)上清時(shí)可過(guò)同一個(gè)吸附柱编矾。
注意：菌體量以能夠充分裂解為佳窄俏，過(guò)多的菌體裂解不充分會(huì)降低質(zhì)粒的提取效率凹蜈。另外仰坦，務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌沉淀悄晃，如果有未徹底混勻的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
4反番、向離心管中加入500μl溶液P2 恬口，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次使菌體充分裂解。由于P2裂解不應(yīng)超過(guò)5 min蛾洛，以免質(zhì)粒受到破壞轧膘。故加入P2前將計(jì)時(shí)器定時(shí)4 min谎碍，以免超過(guò)時(shí)間蟆淀。但是時(shí)間也不可過(guò)短，以免裂解不徹底疑苔。每管操作時(shí)間盡量一致惦费。
注意：溫和地混合不要?jiǎng)×艺鹗幮狡叮悦馕廴净蚪MDNA 后雷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠臀突，如果未變得清亮候学，可能由于菌體過(guò)多隐圾，裂解不徹底暇藏，應(yīng)減少菌體量盐碱。
5瓮顽、向離心管中加入700μl溶液P3（記得冰上預(yù)冷）围橡，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次暖混，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀翁授。放置冰上10min拣播，之后12000rpm ( -13400g ）離心10 min，此時(shí)在離心管底部形成沉淀黔漂。如果上清量較大，需要多次過(guò)柱炬守，可將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中牧嫉，以免沉淀飄起。
注意：P3 加入后應(yīng)立即混合减途，避免產(chǎn)生局部沉淀酣藻。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清鳍置。
6辽剧、將上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量為750-800μl）,注意盡量不要吸出沉淀税产。 12000rpm（-13400g ）離心1min怕轿，倒掉收集管中的廢液偷崩，將吸附柱放入收集管中。
7撞羽、可選步驟：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD阐斜，12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液诀紊，將吸附柱重新放回收集管中谒出。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21邻奠，HB101笤喳，JM101，ET12567等）碌宴，這些宿主菌含有大量的核酸酶杀狡，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步贰镣。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α捣卤，TOP10等），這步省略八孝。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇）鸠项，12000rpm（-13400g）離心1 min干跛，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中祟绊。
注意：加入漂洗液PW后楼入，如果室溫靜置2-5 min，有助于更好地去除雜質(zhì)牧抽。
9嘉熊、重復(fù)操作步驟8。
10扬舒、將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）離心2 min阐肤，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切讲坎、PCR 等）實(shí)驗(yàn)孕惜。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋晨炕，置于室溫放置數(shù)min衫画，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11瓮栗、將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中削罩，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫緩沖液EB（65℃預(yù)熱）瞄勾，室溫放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中弥激。
注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率进陡，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中．重復(fù)步驟
11、洗脫液的pH 值對(duì)于洗脫效率有很大影響秆撮。若用水做洗脫液四濒，應(yīng)保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(nèi)（可以用NaOH 將水的pH 值調(diào)到此范圍）, pH 值低于7.0 會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100μl职辨，體積過(guò)小影響回收效率盗蟆，但也不應(yīng)過(guò)大，以免所提質(zhì)粒濃度過(guò)低舒裤，影響后面的使用喳资。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解腾供。
結(jié)果判斷
1仆邓、使用紫外分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)粒濃度及純度進(jìn)行測(cè)定
（1）檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm和280nm，濃度看OD260伴鳖，OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml节值；純度看OD260/OD280，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9榜聂，偏低可能是蛋白質(zhì)污染搞疗，偏高則可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液须肆，而使用去離子水匿乃，比值會(huì)偏低，但并不表示純度低豌汇，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值幢炸。另外，測(cè)出來(lái)的OD260和OD280都應(yīng)該在0.1-2.0之間拒贱，不然所得出的濃度和純度不準(zhǔn)確宛徊。
（2）應(yīng)該注意的是作為空白對(duì)照的blank管稀釋方法應(yīng)該和所測(cè)樣品管一樣（如樣品為2μl所提質(zhì)粒+48μl ddH2O，則blank為2μl洗脫液+48μl ddH2O）逻澳。
2岩调、酶切鑒定，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
（1）選用合適的內(nèi)切酶對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行酶切赡盘，并與未切質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化用原質(zhì)粒一起用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)号枕，根據(jù)酶切結(jié)果及所提質(zhì)粒與原質(zhì)粒位置是否一致，可以判定所提質(zhì)粒是否為目的質(zhì)粒陨享。
（2）所提質(zhì)粒（未酶切）的電泳條帶可能為一條帶葱淳，也可能為二到三條帶钝腺，這是因?yàn)橘|(zhì)粒提取過(guò)程中操作過(guò)于劇烈可能使環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA單鏈出現(xiàn)缺口（保持環(huán)狀，失去超螺旋）赞厕，或雙鏈斷裂（變成線狀）艳狐，三種構(gòu)型的質(zhì)粒分子在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率是不一樣的，因此會(huì)出現(xiàn)多條帶皿桑，這也說(shuō)明所得質(zhì)粒不夠理想毫目。
測(cè)序結(jié)果的分析
構(gòu)建好質(zhì)粒之后我們一般先酶切鑒定，鑒定正確的可以直接拿去轉(zhuǎn)染然后做WB檢測(cè)表達(dá)即可诲侮。
可以正常表達(dá)的質(zhì)粒我們需要送到測(cè)序公司測(cè)序镀虐，也可以直接送菌液測(cè)序，有些測(cè)序公司還提供質(zhì)粒返還服務(wù)（即送菌液返還他們抽提的質(zhì)粒）沟绪。
測(cè)序的引物一般使用通用引物刮便，如果沒有通用引物需要自行設(shè)計(jì)。常用的通用引物如下：
在公眾號(hào)內(nèi)回復(fù)“通用測(cè)序引物”獲取此Excel绽慈！
測(cè)序結(jié)果返回之后我們就可以分析測(cè)序結(jié)果了恨旱。
一般常用的序列比對(duì)軟件有DNAMAN和Chromas，當(dāng)然坝疼，還有很多類似軟件搜贤，大家可以根據(jù)個(gè)人習(xí)慣選擇，在這里就不一一介紹了钝凶。
DNAMAN
1. 首先打開軟件入客，左側(cè)數(shù)字為各個(gè)通道的編號(hào)，每個(gè)通道只能載入一個(gè)序列：
2. 然后點(diǎn)擊File->New腿椎，將我們目的基因的CDS序列粘貼進(jìn)去，Ctrl+A全選夭咬，右鍵選擇Load Selected Sequence啃炸，將序列載入通道1。
3. 選擇通道2（點(diǎn)擊數(shù)字2即可）卓舵，點(diǎn)擊File->Open打開測(cè)序回來(lái)的序列信息（后綴為.seq）南用，同樣全選右鍵載入通道2，之后點(diǎn)擊Sequence->Multiple Sequence Alignment掏湾；
4. 在彈出窗口中裹虫，點(diǎn)擊Channel，選中需要比對(duì)序列的通道融击，點(diǎn)擊OK即可：
5. 后面基本是一直點(diǎn)擊下一步筑公，在如下圖窗口中選中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出來(lái)如下結(jié)果尊浪，即可比對(duì)測(cè)序結(jié)果和原CDS序列匣屡，如果有突變我們需要看一下是否是同義突變封救，如果是即質(zhì)粒序列正確。
Chromas
1. 用Chromas軟件打開測(cè)序返還的序列信息捣作，然后點(diǎn)擊File->Blast Search:
