本文以白細(xì)胞介素6為例洋闽，介紹基因工程重組質(zhì)粒構(gòu)建的一般步驟怕犁。
1.準(zhǔn)備
本文使用到的兩個(gè)軟件為Vector-NTI-Advance和snapgene：
Vector-NTI-Advance可在http://en.freedownloadmanager.org/Windows-PC/Vector-NTI-Advance.html下載安裝；snapgene在 https://www.snapgene.com/ 下載安裝免費(fèi)試用版本堕扶。
2.相關(guān)DNA或RNA的尋找
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中可以找到相關(guān)DNA或RNA
本文所使用的是白細(xì)胞介素6（IL-6）對(duì)應(yīng)mRNA:Human interleukin 6 mRNA, complete cds? ? ?Accession: M54894.1 GI: 186351
網(wǎng)址為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M54894.1
使用Vector-NTI-Advance打開(kāi)后如圖
3.結(jié)構(gòu)基因的確定
點(diǎn)擊左側(cè)欄中的feature map喇嘱，然后點(diǎn)擊CDS文件夾仿野，可以發(fā)現(xiàn)，其51-689bp區(qū)間為其結(jié)構(gòu)基因，故截取該段基因作為目的基因静稻，接下來(lái)即將該段目的基因轉(zhuǎn)移到載體上
（CDS是Coding sequence的縮寫(xiě)警没，是編碼蛋白產(chǎn)物的序列，是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)術(shù)語(yǔ)）
鼠標(biāo)框選區(qū)段即為目的基因區(qū)段
4.選擇質(zhì)粒
質(zhì)琳裢澹可在snapgene的官網(wǎng)序列庫(kù)中找到杀迹，本文選取pET-30b(+)作為載體
下載后為dna格式
用snapgene打開(kāi)后可以看到如圖結(jié)構(gòu)
5.酶切位點(diǎn)的選擇
從圖譜中選擇多克隆位點(diǎn)區(qū)域MCS，點(diǎn)擊押搪，并轉(zhuǎn)到序列頁(yè)面
同時(shí)新建DNA序列树酪，將上文提到的目的基因的序列粘貼進(jìn)去，用于后續(xù)的酶切位點(diǎn)分析
1.打開(kāi)SnapGene大州，點(diǎn)擊New DNA File续语，彈出以下窗口：
need-to-insert-img
在Create the following sequence窗口下輸入DNA序列，并對(duì)該文件命名厦画，點(diǎn)擊OK疮茄。或是 點(diǎn)擊Import from Genebank根暑，輸入NCBI中某序列的access number力试，點(diǎn)擊OK。
2．此時(shí)彈出如下窗口：
need-to-insert-img
3.對(duì)該序列進(jìn)行注釋：點(diǎn)擊Features→Add Feature排嫌，對(duì)該序列進(jìn)行命名注釋懂版。
△創(chuàng)建質(zhì)粒圖譜文件方法相同。
酶切位點(diǎn)分析
雙酶切連接的酶需要滿足以下要求：
1.酶切位點(diǎn)需要存在于MCS中躏率，但同時(shí)不能存在于目的基因序列中躯畴。
2.兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間至少要有幾個(gè)堿基間隔，不能緊鄰或重疊薇芝。
3.最好選擇成熟的內(nèi)切酶蓬抄。
按照以上原則，篩選酶切位點(diǎn)
本文篩選了BamHI和HindⅢ兩個(gè)具有相同buffer的酶切位點(diǎn)
6.設(shè)計(jì)引物
1）PCR引物繪制：打開(kāi)上文建立好的目的基因文件夯到，在目的基因兩側(cè)截取15-30bp序列嚷缭，點(diǎn)擊Primers→Add primers，選擇top strand或bottom strand耍贾。起始端選擇top阅爽，終止端選擇bottom。
選擇的酶切位點(diǎn)為上文中根據(jù)質(zhì)粒篩選的酶切位點(diǎn)
末端引物類似荐开，但要除去終止子
7.擴(kuò)增
設(shè)計(jì)好引物后付翁，按CTRL+D或在工具欄中使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)入如圖頁(yè)面：
通過(guò)shift鍵選擇兩個(gè)引物晃听，點(diǎn)擊右下角PCR按鈕百侧，得到擴(kuò)增序列砰识。
8.重組質(zhì)粒構(gòu)建
點(diǎn)擊Actions→Insert Fragment，用鍵盤(pán)Shift鍵點(diǎn)選上文提到的兩個(gè)酶切位點(diǎn)佣渴，點(diǎn)擊Insert辫狼，在source of fragment處選擇插入的目的片段來(lái)源。
將擴(kuò)增后的目的基因文件拖動(dòng)到插入框中辛润，在右邊欄中選擇酶切位點(diǎn)膨处，點(diǎn)擊右下角得到重組質(zhì)粒。
snapgene的部分操作可以參考
http://www.sci666.net/59928.html
