張澤民大佬剛剛online的nature把鉴，來學(xué)習(xí)一下诗宣。

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer, PLC)有三種主要的組織學(xué)亞型-肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)秽荤，肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管癌合并(combined hepatocellular and intrahepatic cholangiocarcinoma, CHC)。盡管免疫治療最近取得了進(jìn)展，但我們對PLC的腫瘤免疫微環(huán)境基線情況的了解有限文捶，從而排除了生物標(biāo)志物的識別吱瘩，以更好地對患者進(jìn)行分層道伟。因此需要一項(xiàng)全面的單細(xì)胞研究，包括大多數(shù)細(xì)胞群和PLC的三個(gè)主要亞型，并具有既定的臨床參數(shù)蜜徽。
腫瘤免疫微環(huán)境(tumour immune microenvironment, TIME)由各種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組織祝懂，其異質(zhì)性是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的主要促成因素拘鞋，但不同的TIME亞型與肝癌的臨床相關(guān)性之間的關(guān)系尚不清楚砚蓬。

這項(xiàng)研究分析了189個(gè)肝癌患者和小鼠模型樣本的細(xì)胞景觀，解剖了TIME亞型盆色，從而揭示了肝癌免疫微環(huán)境亞型和中性粒細(xì)胞異質(zhì)性怜械。

1. A large-scale single-cell atlas of liver cancer

Fig 1：為了探究PLC的細(xì)胞群異質(zhì)性，作者對來自124個(gè)原發(fā)性肝癌患者的（79 HCC, 25 ICC 和 7 CHC）160個(gè)樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測序傅事。得到了1,092,172個(gè)細(xì)胞缕允，鑒定為89 TIME細(xì)胞群。

2. Cellular module analyses reveal five TIME subtypes

Fig 2a：Hierarchy clustering 鑒定出5個(gè) stable cellular modules (CM1–CM5)蹭越。也就是5個(gè)免疫微環(huán)境亞型（TIMELASER）障本。
Fig 2b-d：基于CM1–CM5的富集評分，作者將所有的患者區(qū)分為5個(gè)TIME subtypes响鹃。其中包含：免疫激活型TIME-IA (Immune Activation);髓系富集免疫抑制型TIME-ISM (Immune Suppressive Myeloid);基質(zhì)富集免疫抑制型TIME-ISS (Immune Suppressive Stromal);免疫排斥型Immune Exclusion (TIME-IE);免疫駐留型(Immune Residence)驾霜，組合起來稱之為TIMELASER分型系統(tǒng)。
Fig 2e：五種分型的患者預(yù)后
Fig 2f：以TIME-IE為例买置，免疫熒光驗(yàn)證了免疫微環(huán)境亞型的存在粪糙。

3. TIMELASER subtypes exhibit distinct features

Fig 2g-h：通過受體配體分析發(fā)現(xiàn)每種亞型均存在不同的趨化因子受體-配體網(wǎng)絡(luò)，提示了不同亞型的形成機(jī)制忿项。TIME-IA 和 TIME-ISM亞型的tumour和TIME細(xì)胞存在一致的趨化因子表達(dá)模式蓉冈，提示存在positive-feedback loops。例如CXCL9/10/11–CXCR3 受體配體對在 TIME-IA中富集, 而 CXCL1/3/8–CXCR2 受體配體對則在TIME-ISM 中富集轩触。

4. Neutrophil heterogeneity in liver cancer

TIME-ISM中多種中性粒細(xì)胞亞群的富集以及其不良預(yù)后使得作者想要對中性粒進(jìn)行進(jìn)一步探究寞酿。
Fig 3a-b：在人樣本的34,307個(gè)中性粒中，作者一共鑒定出11個(gè)亞群脱柱。不同的亞群具有不同的腫瘤偏好性伐弹。Neu_02_S100A12, Neu_03_ISG15 和 Neu_04_TXNIP 主要是外周血中性粒 (PBNs), 而 Neu_05_ELL2 和 Neu_06_PTGS2 主要是 adjacent liver neutrophils (ALNs)。其他的六個(gè)亞群 (Neu_01_MMP8, Neu_07_APOA2, Neu_08_CD74, Neu_09_IFIT1, Neu_10_SPP1 和 Neu_11_CCL4) 則主要在腫瘤中富集榨为，也就是TANs惨好。
Fig3a的結(jié)果還提示存在著從PBNs--ALNs--TANs的分化軌跡。
Fig 3c：轉(zhuǎn)錄因子分析提示不同中性粒亞群受到不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控随闺。例如PAN中SPI1高度活化日川， ALNs 和 TANs中 NFE2L2 和 CREM則活性更強(qiáng)。MAFG, BHLHE40 和 HES4在 TANs中高度活化板壮，可能參與腫瘤中的中性粒細(xì)胞重編程逗鸣。

5. Chemokine secretion and immunosuppression phenotypes of TANs

作者隨后主要關(guān)注了兩個(gè)TAN亞群Neu_11_CCL4 和 Neu_09_IFIT1 的功能合住。
Fig 3d：Neu_11_CCL4高表達(dá)趨化因子CCL3 和 CCL4绰精。
Fig 3e：體外誘導(dǎo)的TANs同樣高表達(dá)CCL4撒璧。
Fig 3f, g：隨后作者通過ex vivo analysis探究了patient-derived TANs 和非腫瘤中性粒細(xì)胞的趨化因子分泌情況。結(jié)果顯示和non-TANs相比, TANs顯示出 higher accessibility signals of CCL4 and CCL4 protein secretion笨使。
Fig 3h：TAN對單核細(xì)胞的趨化作用也更強(qiáng)卿樱。These results validate the chemokine-secreting function of TANs and support that CCL4⁺ TANs could recruit macrophages.

Fig 3i：同樣的，作者發(fā)現(xiàn)和非腫瘤細(xì)胞相比硫椰，TANs的CD274 (編碼 PD-L1)表達(dá)顯著更高繁调，尤其是Neu_09_IFIT1。
Fig 3j：in vitro induced TANs的CD274表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性靶草，時(shí)間越長蹄胰，表達(dá)越多。
Fig 3k：流式結(jié)果也顯示和正常組相比奕翔，induced TANs顯示出更高的PD-L1表達(dá)裕寨。
Fig 3l-m：ATAC-seq 和 FAC結(jié)果也顯示patient-derived TANs存在higher accessibility signals of CD274 and PD-L1 expression。

為了探究TANs的高PD-L1表達(dá)可以直接抑制T細(xì)胞活性派继，作者將CD8⁺ T細(xì)胞和in vitro induced TANs共培養(yǎng)宾袜。
Fig 3n, o：結(jié)果顯示和TANs共培養(yǎng)的CD8⁺ T的IFN-r表達(dá)下降，給PD-L1抗體后這種現(xiàn)象消失驾窟。提示PD-L1 介導(dǎo)了TAN的免疫抑制作用庆猫。
Fig 3p：此外，和人TANs共培養(yǎng)的autologous CD8⁺ T細(xì)胞的IFNγ, GZMB, PRF1 和 CD25 表達(dá)水平更低绅络。
Fig 3q：免疫熒光結(jié)果顯示PD-L1⁺ 中性粒細(xì)胞和 PD1⁺ CD8⁺ T細(xì)胞存在空間上的共定位月培，提示它們存在直接互作。
These results together demonstrate that PD-L1⁺ TANs suppress cytotoxic CD8⁺ T cells in PLC.

Fig 3

6. Conserved neutrophil subsets in human and mouse liver cancer

為了進(jìn)一步在體探究TANs的異質(zhì)性恩急，作者構(gòu)建了兩個(gè)新的自發(fā)性肝癌小鼠模型节视， with the pTMC mice developing mainly HCC and pTMK mice developing mainly ICC。作者對6只小鼠的21個(gè)樣本（包括外周血假栓，癌旁和癌組織）進(jìn)行了單細(xì)胞測序寻行。
Fig 4a-b：作者一共得到17,780個(gè)中性粒，分為12個(gè)cluster匾荆。和人的中性粒一樣(Fig 3a)拌蜘，小鼠中性粒細(xì)胞也存在從PBNs--ALNs--TANs的分化軌跡。
Fig 4c：對人和小鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在物種間保守牙丽。
Fig 4d：尤其值得注意的是简卧，3種來自人TIME-ISM (Neu_09/10/11)的TAN 亞群和小鼠的mNeu_10/11/12相對應(yīng)。和人類TANs一致烤芦，在小鼠TANs中也觀測到了 Cd274 的高表達(dá)举娩。

7. Neutrophil depletion attenuates tumour progression

TIME-ISM TANs (Neu_09/10/11)的綜合促腫瘤作用使得作者想要去進(jìn)一步探究體內(nèi)消除這些促腫瘤TANs的治療作用。

As a combinatory in vivo elimination strategy specifically targeting Neu_09/10/11 was not available, we reasoned that neutrophil depletion using anti-Ly6G antibodies might be the most proximate way to mimic such therapy.

Fig 4e, f：中性粒細(xì)胞清除之后，腫瘤結(jié)節(jié)顯著減少铜涉，腫瘤縮小智玻。
Fig 4g, h：TANs的數(shù)量 和 表達(dá)PD-L1的 TANs在治療后都顯著下降。盡管CD8T細(xì)胞的數(shù)量沒有變化芙代，它們的耗竭狀態(tài)減輕（PD-1和TIM3等檢查點(diǎn)marker表達(dá)下降）吊奢。總的中性粒細(xì)胞數(shù)量和增殖腫瘤細(xì)胞數(shù)量也下降纹烹。
Fig 4i-j：另外一個(gè)小鼠模型也是一樣的效果页滚。

總的來說，這項(xiàng)研究描繪了PLC的全面細(xì)胞景觀铺呵，使我們能夠識別五種TIMELASER亞型并解碼中性粒細(xì)胞異質(zhì)性裹驰。TIMELASER框架覆蓋了大多數(shù)細(xì)胞群，并提供了顯示空間分辨率的基線TIME亞型的無偏分層片挂。進(jìn)一步探索中性粒細(xì)胞對免疫治療的影響以及相關(guān)的混雜臨床因素將為更好地理解TAN生物學(xué)提供新的機(jī)會邦马，并提出肝癌治療的轉(zhuǎn)化研究路徑。