Chugai 公司 2022 年發(fā)表的《通過pH依賴的抗原結(jié)合及新 Fc 工程方法清除食蟹猴血清中的可溶性抗原》文章第晰，學(xué)習(xí)一下。針對(duì)循環(huán)中的可溶性抗原彬祖，通常需要大劑量高頻率的靜脈注射去中和抗原茁瘦。這是因?yàn)?antigen 的降解是以抗原-抗體免疫復(fù)合物的形式，它可以利用 FcRn 介導(dǎo)的循環(huán)储笑，逃避溶酶體的降解甜熔。Sweeping antibody 可以通過增加細(xì)胞免疫復(fù)合物的攝取，并在酸性內(nèi)體中與抗原解離南蓬，有效清除血清抗原纺非。強(qiáng)力的 antigen sweeping 可以減少藥物劑量，擴(kuò)展抗體的空間作用范圍赘方。
在這項(xiàng)研究中，為了提高 sweeping 效率弱左，文章開發(fā)了一種新的 Fc 突變體窄陡，提高了與 FcγRIIb 的結(jié)合，調(diào)節(jié)電荷性質(zhì)增加細(xì)胞對(duì)免疫復(fù)合物的攝取拆火，并且增強(qiáng)與 FcRn 的結(jié)合來有效地挽救 antigen-free 抗體跳夭。文章開發(fā)的 Fc 突變體在食蟹猴中獲得了很強(qiáng)抗原清除效率，其抗體藥代動(dòng)力學(xué)與野生型人 IgG1 抗體相當(dāng)们镜。
在體外實(shí)驗(yàn)中币叹，正電荷替換增強(qiáng)了表達(dá) FcγRIIb 細(xì)胞對(duì)免疫復(fù)合物的攝取，這種攝取被 anti-FcγRIIb 抗體完全抑制模狭。這表明 強(qiáng)抗原清除 主要是依賴電荷替換后 FcγRIIb 對(duì)抗原復(fù)合物攝取實(shí)現(xiàn)的颈抚，而不是非特異性攝取實(shí)現(xiàn)。文章期望新的 Fc 工程可以最大限度地提高抗原清除效果嚼鹉，并創(chuàng)造新的治療抗體贩汉。
1 引言
可溶性抗原被細(xì)胞攝取后，酸性內(nèi)體中的 free antigens 可以被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解锚赤，但是抗原-抗體免疫復(fù)合物可以利用 FcRn 介導(dǎo)的循環(huán)匹舞，再次釋放到血液循環(huán)中。 近些年新開發(fā)的 pH-dependent 抗體可以在酸性 pH 下與抗原弱結(jié)合线脚，pH 中性下強(qiáng)結(jié)合赐稽，在酸性內(nèi)體中與抗原解離叫榕，可以達(dá)到很好的抗原清除的目的。細(xì)胞膜上的負(fù)電荷和抗體上的正電荷相互作用姊舵，可以增加免疫復(fù)合物的攝取翠霍。但是，抗體上的正電荷也會(huì)增加抗體的清除蠢莺，因此需要綜合考慮寒匙。Fc variant 采用的功能組合 : FcγRIIb binding increase + Charge engineering + FcRn binding increase + Fab pH sensitive
2結(jié)果
2.1 設(shè)計(jì)強(qiáng) sweeping antibody
1、 NpH-IgG1 為非 pH sensitive 抗體躏将，pH-IgG1 為 pH sensitive 抗體锄弱。表 1 中列出了 SPR 測(cè)定的與 myostatin 在不同 pH 下的親和力；
2.2 特異性增強(qiáng)結(jié)合 FcγRIIb 突變篩選
1祸憋、之前研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)與 FcγRIIb 的結(jié)合会宪，可以增強(qiáng)可溶性抗原的清除。因此需要篩選特異性增強(qiáng)結(jié)合 FcγRIIb 突變蚯窥，而且為了保證不引起有害的免疫激活掸鹅，同時(shí)要求與其他激活型 FcγRs 弱結(jié)合；
2拦赠、表 2 中V3組合的突變效果最好巍沙，F(xiàn)c 與人源和猴的 FcγRIIb binding 與 WT 相比，分別增強(qiáng)了 3.06 倍和 2.86 倍荷鼠；
2.3 正電荷替換引起細(xì)胞攝取免疫復(fù)合物效應(yīng)增強(qiáng)及抗體藥物動(dòng)力學(xué)
1句携、之前研究發(fā)現(xiàn)Fc電荷替換可以減少 antigen 的聚集。在 pH-dependent IgG1 上進(jìn)行了 pI(A), pI(B), pI(C) 組合突變允乐，這些突變沒有影響 Fc 與 FcγRs 的結(jié)合矮嫉，如表2所示；
2牍疏、通過體外胞吞實(shí)驗(yàn)蠢笋，驗(yàn)證了pI(A), pI(B), pI(C) 突變體的胞吞效果，如Fig2A; 也測(cè)定了血清中抗體清除的動(dòng)力學(xué)鳞陨， pI(A)的影響較小昨寞，如Fig2B；
2.4 增強(qiáng)結(jié)合 FcγRIIb 突變和正電荷替換突變?cè)谛∈篌w內(nèi)對(duì)可溶性抗原清除的影響
1炊邦、pH-V3-pI(A) 编矾、V3-N434A 、V3-pI(A)-N434A 與Fc receptor 的結(jié)合參數(shù)如表2所示馁害；
2窄俏、myostain 的清除效率如Fig3a 所示，pH-V3（增強(qiáng)結(jié)合 FcγRIIb 突變）增強(qiáng)了清除率碘菜，pH-V3-pI(A)（增強(qiáng)結(jié)合 FcγRIIb 突變和正電荷替換突）清除率更高凹蜈；
2.5 Fc engineering 對(duì)食蟹猴中內(nèi)源性抗原濃度的影響
1限寞、添加 N434A 突變至pH-V3、pH-V3-pI(A) 上仰坦，期望增加與 FcRn 的 binding , 獲得更長的半衰期延長效果履植；
2、 如圖Fig4a 所示悄晃，血清中總 myostatin 濃度玫霎，NpH-IgG1 組最高，依次為 pH-IgG1妈橄、pH-V3-N434A庶近、Vehicle、pH-V3-pI(A)-N434A; pH-V3-pI(A)-N434A 效果最好眷蚓，抗原總濃度在基線以下鼻种；
3、如圖Fig4b 所示沙热，抗體的清除率影響不明顯叉钥；
2.6 Fc engineering 改造 FcγRIIb 介導(dǎo)的胞吞作用增強(qiáng)
1、血清中抗原抗體復(fù)合物的清除主要依靠 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞 和 庫普弗細(xì)胞 ,它們都表達(dá) FcγRIIb篙贸；
2投队、為了驗(yàn)證電荷替換對(duì)體內(nèi) antigen sweeping 的影響，使用表達(dá)/不表達(dá) huFcγRIIb 的CHO細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證歉秫；含有 pH-V3-pI(A) 突變組合的組結(jié)合和內(nèi)吞最強(qiáng)蛾洛，含有 anti-huFcγRIIb 抗體（2B6）組被完全抑制；這表明正電荷替換可以增強(qiáng) FcγRIIb 結(jié)合和 FcγRIIb 介導(dǎo)的特異性胞吞雁芙，而不是非特異性胞吞。
3 討論
1钞螟、由于質(zhì)膜是帶負(fù)電荷兔甘，細(xì)胞膜上的負(fù)電荷和抗體上的正電荷相互作用，可以增加免疫復(fù)合物的胞吞作用鳞滨；
2洞焙、前期工作已經(jīng)驗(yàn)證了Fc engineering的突變不會(huì)影響抗體的熱穩(wěn)定性和聚集等特性，但是會(huì)影響C1q的作用拯啦，因?yàn)镕cγRIIb 和 C1q的作用區(qū)域重合澡匪；
4 參考文獻(xiàn)
[1] Hori Y, Ohmine K, Katada H, Noguchi Y, Sato K, Nambu T, Adeline LR, Wan GS, Haraya K, Ozeki K, Nanami M, Tachibana T, Sampei Z, Kuramochi T, Nezu J, Hattori K, Igawa T. Elimination of plasma soluble antigen in cynomolgus monkeys by combining pH-dependent antigen binding and novel Fc engineering. MAbs. 2022 Jan-Dec;14(1):2068213. doi: 10.1080/19420862.2022.2068213. PMID: 35482905; PMCID: PMC9067469.
