回顧
1995年，Kumagai等人通過攜帶幾乎相同序列的重組病毒發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）鲤拿。
1997年，VIGS這一術(shù)語最早被Van Kammen用于描述植物受病毒侵染后的癥狀恢復(fù)現(xiàn)象。
1999年，Baulcombe認(rèn)識到客扎，由于VIGS允許通過講解特定基因的轉(zhuǎn)錄本來有針對性地下調(diào)該基因，VIGS將被作為基因功能研究的潛力巨大罚斗。
2004年徙鱼，Burch-Smith通過使用重組病毒來沉默植物內(nèi)源基因，此后针姿，VIGS作為一種反向遺傳學(xué)技術(shù)被研究者廣泛使用袱吆。
病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是指攜帶目的基因片段的病毒侵染植物后搓幌，隨著病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而特異性的誘導(dǎo)序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修飾杆故，從而引起植物內(nèi)源基因沉默迅箩、引起表型或生理指標(biāo)變化溉愁，進(jìn)而根據(jù)表型變異研究目標(biāo)基因的功能。
VIGS是根據(jù)植物對RNA病毒防御機(jī)制發(fā)展起來的一種用以表征植物基因功能的基因轉(zhuǎn)錄技術(shù)，其內(nèi)在的分子基礎(chǔ)可能是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcript gene silence)拐揭。
與傳統(tǒng)的基因功能分析方法相比撤蟆，VIGS能夠在侵染植物當(dāng)代對目標(biāo)基因進(jìn)行沉默和功能分析；無需開發(fā)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子堂污，并且具有沉默單個或多個基因家族成員的潛力家肯。
因此，VIGS一經(jīng)建立盟猖，即被視為研究植物基因功能的強(qiáng)有力工具讨衣，得到了深入的研究和廣泛應(yīng)用，已用于煙草式镐、番茄反镇、小麥、水稻等植物的抗病反應(yīng)娘汞、生長發(fā)育以及代謝調(diào)控的功能基因研究歹茶。
沉默機(jī)制
基因沉默在生物中普遍存在，表現(xiàn)在抵御病毒你弦、轉(zhuǎn)座子等外來核酸的入侵惊豺，識別并抑制外源基因表達(dá)，維持生物基因組穩(wěn)定性等禽作。
VIGS 作為基因沉默的特殊形式尸昧，是植物抗病毒侵染的一種自然機(jī)制。當(dāng)病毒或攜帶cDNA 的病毒載體侵染植物后领迈，在復(fù)制與表達(dá)過程中通常會形成雙鏈RNA（Double stranded RNA彻磁，dsRNA）形式的中間體。
dsRNA 作為基因沉默關(guān)鍵激發(fā)子狸捅，首先在細(xì)胞中被類似RNase Ⅲ家族特異性核酸內(nèi)切酶Dicer 類似物（如DCL4）切割成21 ~ 24 nt 的小分子干擾RNA（Small interfering RNA衷蜓，siRNA）。
siRNAs 在植物細(xì)胞內(nèi)被依賴RNA 的RNA 聚合酶1（RNA-dependent RNA polymerase 1尘喝，RDR1）磁浇、RDR2 或RDR6進(jìn)一步擴(kuò)增，并以單鏈形式與Agronaute1（AGO1）蛋白等結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex朽褪，RISC）置吓，RISC 特異地與細(xì)胞質(zhì)中的同源RNA 互作，導(dǎo)致同源RNA 降解缔赠，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing衍锚，PTGS）發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）嗤堰。
VIGS 可以分為兩種類型戴质，即轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）和轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS）。
影響VIGS效率的因素及缺陷分析
- 插入片段與靶基因的同源性顯著影響VIGS 的效率
由于VIGS 的作用機(jī)制基于核苷酸序列同源性，兩者序列同源性越高告匠，基因沉默效果越好戈抄，基因片段如果選擇不當(dāng)可能會造成基因沉默的“脫靶”，從而得不到有效的沉默表型后专。
疑惑：植物中很多基因都以家族形式存在划鸽，尤其對于小麥基因組而言，基因家族普遍龐大戚哎，家族成員往往在幾十到幾千不等裸诽，家族內(nèi)各成員的序列又具有很高的相似性。所以型凳，如果只沉默基因家族中的某個特定基因崭捍，則必須在其特異序列上選取靶基因片段，這一步對插入序列的選擇就得仔細(xì)啰脚；如果要沉默基因家族內(nèi)的多個基因殷蛇，則必須選取基因家族的共有保守序列，以避免不同基因之間的功能互補而達(dá)不到良好的沉默效果橄浓。
- 靶基因片段的長度
插入病毒載體的基因片段長度應(yīng)在200~350 bp之間粒梦。過短則有可能由于不能滿足特異性匹配的要求而導(dǎo)致沉默掉非靶標(biāo)基因；過長則有可能造成插入片段的丟失荸实，或失去系統(tǒng)侵染能力匀们。
- 靶基因片段的方向
一般而言，靶基因片段反向插入VIGS 載體比正向插入誘導(dǎo)的基因沉默效率要高准给。但不絕對泄朴。
- 環(huán)境溫度
一般情況下，高溫環(huán)境會導(dǎo)致植物體內(nèi)病毒含量顯著降低露氮，基因沉默的效率亦明顯降低祖灰；而在較低的溫度條件下，病毒的含量和基因沉默的效率都顯著地上升畔规。
- vigs體系中的PDS是什么局扶？
八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素合成途徑中的一個關(guān)鍵酶叁扫，當(dāng)PDS 表達(dá)受阻時三妈，植物便喪失了類胡蘿卜素的光保護(hù)作用，從而呈現(xiàn)出白化效應(yīng)莫绣。也常以此作為接毒成功與否的參照畴蒲。
展望
VIGS作為快速表征感興趣基因表型的篩選技術(shù)，對特定物種病毒載體的改造應(yīng)該值得被重視对室。
關(guān)于VIGS技術(shù)的一篇文獻(xiàn)模燥，我覺得很可狞玛。
2019年，中科院上海植物逆境中心 Alberto P.Macho 課題組在 NbSGT1-VIGS 實驗過程中發(fā)現(xiàn)：利用 TRV 沉默系統(tǒng)產(chǎn)生的 NbSGT1-VIGS 的本氏煙中涧窒，NbSGT1 能夠有效被沉默，然而通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)系統(tǒng)會受到影響锭亏，例如 GFP 蛋白不能有效被轉(zhuǎn)錄與表達(dá) (Fig.1)纠吴。
而通過相似的方法沉默其他免疫相關(guān)蛋白，如 NbEDS1, NbNDR1 不會產(chǎn)生類似的效果慧瘤，此外前期文獻(xiàn)報道戴已，SGT1-VIGS 煙草中 SA 含量會升高，而且本文中也報道 NbSGT1-VIGS 煙草中 PR1 表達(dá)量會升高锅减，表明持續(xù)沉默 SGT1 可能會影響到 SA 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)糖儡，從而影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的異源蛋白表達(dá)。
研究人員還發(fā)現(xiàn)怔匣，NbSGT1-VIGS 一周后握联，NbSGT1 能夠有效被沉默，而此時農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源蛋白表達(dá)不明顯受影響每瞒。
該研究工作表明金闽，在利用 NbSGT1-VIGS 本氏煙進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)時，需要通過 westernblot 檢測蛋白表達(dá)剿骨，從而得出相關(guān)結(jié)論代芜。
【Reference】
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Burch-Smith TM, Anderson JC, Martin GB, Dinesh-Kumar SP. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 2004 Sep;39(5):734-46. doi: 10.1111/j.1365-313X.2004.02158.x. PMID: 15315635.
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Yu G, Xian L, Sang Y, Macho AP. Cautionary notes on the use of Agrobacterium-mediated transient gene expression upon SGT1 silencing in Nicotiana benthamiana. New Phytol. 2019 Apr;222(1):14-17. doi: 10.1111/nph.15601. Epub 2018 Dec 11. PMID: 30451288.
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宋震,李中安,周常勇.病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報,2014,41(09):1885-1894.
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