22年2月的circ胀滚，葛均波教授和孫愛軍教授團隊的paper

1. Lgmn Expression Increases After MI in Mice

為了確定參與endocytosis 和 intracellular trafficking的潛在基因承匣，作者比較了MI手術(shù)后不同時間點心臟巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)吹艇，結(jié)果顯示有11個基因在MI后早期上調(diào)(a)。而在Immgen和bioGPS databases檢索了這11個基因之后，作者發(fā)現(xiàn)Lgmn在巨噬細胞中特異性表達(b, c)擦俐，因此可能是一個重要的潛在靶點。

Fig 1a-b： qpcr和western結(jié)果顯示Lgmn在梗死后5天心臟的梗死區(qū)和border區(qū)顯著高表達，在非梗死區(qū)無變化秦踪。
Fig 1c： 免疫熒光顯示Lgmn主要與巨噬共定位。
Fig 1d, e： 通過對MHC-II^lowCCR2^-, MHC-II^highCCR2^-和MHC-II^highCCR2⁺巨噬的分選和qpcr掸茅，作者發(fā)現(xiàn)Lgmn主要在MHC-II^lowCCR2^-巨噬表達椅邓。
Fig 1f： 免疫熒光也顯示梗死5天后，Lgmn不與CCR2和MHC-II共定位昧狮。
Fig 1g, h： 在此前的報道中^1,2景馁，TIMD4是心臟組織原位巨噬細胞的marker。作者在梗死后5天的心臟中分選了TIMD4⁺ CCR2^?原位巨噬 , TIMD4^? CCR2^?巨噬和 TIMD4^? CCR2⁺巨噬逗鸣，發(fā)現(xiàn)Lgmn主要在TIMD4⁺ CCR2^?原位巨噬中表達合住。

2. Lgmn Expression Increases in Ischemic Cardiomyopathy

作者在人的樣本中也進行了檢測绰精。同樣的，作者根據(jù)HLA-DR 和 CCR2 的表達將人的心臟巨噬細胞分為了 HLA-DR^high CCR2^?, HLA-DR^high CCR2⁺ 和 HLA-DR^low CCR2⁺透葛。和小鼠中一致笨使，Lgmn在你缺血性心臟病樣本中方新竹升高，且主要是在HLA-DR^high CCR2^?原位巨噬中升高僚害。

3. LGMN Deficiency Exacerbates MI

為了探究Lgmn deficiency在MI中的作用硫椰，作者使用了Lgmn knockout (KO)鼠。結(jié)果顯示敲除鼠在MI術(shù)后心功能更差萨蚕。隨后作者使用了Lgmn^F/F×LysM^Cre鼠靶草，得到了一樣的效果。

4. LGMN Deficiency Augments Accumulation of Apoptotic Cardiomyocytes

Fig 4a-d： Tunel染色和western結(jié)果顯示Lgmn^-/-鼠MI后心肌細胞凋亡增多岳遥。
Numerous reports have linked cardiomyocyte apoptosis to post-MI cardiac repair; however, studies on the fate of the cardiomyocytes after their death are comparatively lacking.
Fig 4e-f： Next, as a surrogate indicator for in vivo efferocytosis, 作者使用免疫熒光檢測了Lgmn KO 和 WT 鼠MI后的心肌和巨噬共定位奕翔。作者計算了 cardiomyocyte-containing macrophages的百分比以確定 LGMN deficiency 是否增強了凋亡心肌的累積。結(jié)果顯示MI后5天浩蓉，Lgmn KO鼠心臟組織中cardiomyocyte-containing macrophages 的百分比顯著下降派继。

直接看TNNI3陽性的巨噬細胞

Fig 4g-h： 隨后作者用了CCR2^GFP; α-MHC-Cre; R26-tdTomato and Lgmn KO; CCR2^GFP; α-MHC-Cre; R26-tdTomato mice。也就是心肌細胞帶紅光妻往，CCR2帶綠光的鼠子互艾。流式顯示，Lgmn KO的鼠子讯泣，MI后組織原位巨噬細胞對心肌細胞的吞噬作用減弱（存在impaired efferocytosis）纫普。其他兩種CCR2陽性巨噬對心肌的吞噬功能沒有變化。（CCR2^GFP在這里好像是個擺設(shè)）

5. LGMN Deficiency Increases Infarction Size

Lgmn^-/-和Lgmn^F/F×LysM^Cre鼠與各自的對照相比好渠，梗死面積都增大昨稼。

6. Lgmn Is Required for the Clearance of Apoptotic Cardiomyocytes

Efferocytosis involves recognition of apoptotic cells by cell receptors and then phagocytosis and phagolysosomal digestion of the apoptotic cells.

參考：

• ??胞葬作用 (Efferocytosis) ：程序性死亡細胞臨終前最后一站
• Science | 胞葬作用：吞噬細胞為凋亡細胞舉辦的盛大葬禮

Figure S5： 對Lgmn-KO 和 WT 鼠 MI后心臟巨噬進行了RNAseq，結(jié)果顯示Lgmn敲除對識別凋亡細胞的受體如CD36, LRP1/CD91, BAI1, TIM4, 和 MerTK沒有顯著影響拳锚。

Thus, we focused on phagocytosis and phagolysosomal digestion of the apoptotic cells.
為了探究Lgmn 對 engulfment 的直接作用假栓，作者將dying primary adult mouse cardiomyocytes (R26-tdTomato⁺)和MHC-II^low CCR2^?組織原位巨噬細胞共培養(yǎng)。作者在Lgmn^?/?巨噬中觀測到了2個主要現(xiàn)象霍掺。

1. 這些巨噬細胞存在impaired high-burden efferocytosis.

Fig 5a, b： 在早期和較低的心肌/巨噬比例下匾荆，Lgmn^?/?巨噬顯示出與control類似的心肌吞噬作用。而隨著共培養(yǎng)時間延長或心肌/巨噬比例增加的情況下杆烁，吞噬作用下降牙丽。
Fig 5c： CypHer5E-labeled cardiomyocyte-derived material的Cell Tracker也得到了一致的結(jié)果。

類似的實驗在TREM2hi原位巨噬細胞通過維持心肌穩(wěn)態(tài)保護膿毒心 也看到過

因此兔魂，作者推測LGMN enabled high-burden efferocytosis in macrophages by facilitating the internalization of multiple cardiomyocyte-derived material. 因此作者進行了2-stage efferocytosis experiment烤芦。作者先將巨噬與calcein AM-labeled cardiomyocyte-derived material共培養(yǎng)了45min，然后移除了心肌material析校，并讓巨噬休息了120min构罗。然后將巨噬與R26-tdTomato–labeled cardiomyocyte-derived material共孵育铜涉。

Fig 5d： 結(jié)果顯示，只有一小部分的Lgmn^?/?內(nèi)吞了兩種心肌遂唧。

2. 第二個現(xiàn)象是Lgmn^?/?巨噬存在phagocytic capacity的下調(diào)芙代，因為更少的凋亡物質(zhì)被內(nèi)吞和處理。

Fig 5e： 為了定量phagolysosomal cargo degradation盖彭，作者將Lgmn^?/?和control巨噬與R26-tdTomato–labeled cardiomyocyte-derived material共培養(yǎng)了45min链蕊，隨后移除了unengulfed cardiomyocyte-derived material，在3小時后檢測了巨噬細胞中的R26-tdTomato谬泌，結(jié)果顯示與對照相比，大量的Lgmn^?/?中存在著nonfragmented cardiomyocyte-derived material逻谦。

7. Lgmn-Deficient Macrophages Exhibit Defective LC3-II–Associated Phagocytic Degradation

由于Lgmn^?/?巨噬細胞存在less fragmentation of the internalized cardiomyocyte-derived material掌实，提示存在phagolysosomal cargo。因此作者探究了這種現(xiàn)象是否由defective LC3-associated phagocytosis所致邦马。
Fig 5f： 作者發(fā)現(xiàn)LGMN deficiency引起了MI后心臟中LC3-II的下調(diào)贱鼻。
Fig 5g： 此外，作者將Lgmn^?/? 和control巨噬與R26-tdTomato–labeled cardiomyocyte-derived material 共培養(yǎng)了1h滋将，隨后移除心肌邻悬，將巨噬細胞固定，使用digitonin去除了nonmembrane-bound LC3随闽，對LC3進行了染色父丰，結(jié)果顯示LC3在cardiomyocyte-containing control macrophages中較多，在Lgmn^?/? macrophages 中下降掘宪。

8. Defective Phagocytic Sealing and Degradation in Lgmn-Deficient Resident Cardiac Macrophages Are Linked to Decreased Cytosolic Calcium

為了探究LGMN與defective efferocytosis的關(guān)系蛾扇，作者首先探究了cytoplasmic calcium 的功能（因為巨噬細胞胞內(nèi)鈣離子的增加對凋亡細胞的清除是必須的，而且cytosolic calcium decreases in response to defective intracellular calcium mobilization in certain settings）魏滚。作者假設(shè)LGMN缺陷可能會使凋亡細胞通過PAR2 (protease- activated receptor 2) 誘導(dǎo)巨噬細胞胞內(nèi)鈣離子增加過程受損镀首，從而引起受損的efferocytosis。
Fig 5h： 作者首先探究了Lgmn^?/?巨噬在暴露于凋亡心肌下時是否存在胞內(nèi)鈣離子水平的改變鼠次。結(jié)果顯示Lgmn^?/?巨噬在吞噬了凋亡心肌后更哄，the mobilization of intracellular calcium was significantly compromised.
Fig 5i： 有文獻報道胞內(nèi)鈣離子的增加是LGMN介導(dǎo)的PAR2 cleavage介導(dǎo)的。作者使用了PAR2 expressing an extracellular FLAG epitope and intracellular HA epitope (FLAG-PAR2- HA) 來證實Lgmn^-/-巨噬中intact PAR2在細胞膜表面被LGMN切割腥寇。巨噬細胞與LGMN (100 nmol/L, Hanks Balanced Salt Solution, pH 5.0) 共孵育成翩，隨后檢測了FLAG 和 HA epitopes，結(jié)果顯示在vehicle-treated macrophages中花颗，F(xiàn)LAG 和 HA epitopes在胞膜共定位捕传，而在與LGMN共孵育之后，只有 HA epitopes 被檢測到扩劝。提示LGMN可以切割PAR2胞外段庸论，引起胞內(nèi)鈣離子升高职辅。

9. LGMN Deficiency Induces MHC-IIhigh CCR2+ and MHC-IIlow CCR2+ Infiltration After MI

總體上，敲除Lgmn沒有引起心臟巨噬的顯著變化(a)聂示。而MI 5天后域携，Lgmn^-/-鼠心臟中性粒和Ly6c⁺單核增加。此外鱼喉，MI 5天后秀鞭，Lgmn^-/-鼠心臟 MHC-II^high CCR2⁺ 和 MHC-II^low CCR2⁺巨噬都增加(c)。但是Lgmn^-/-并沒有顯著影響巨噬的增殖(d)扛禽。對ll10, tgf-b, ifn-r的監(jiān)測提示Lgmn KO 鼠MI后存在delayed inflammation resolution.
Taken together, these findings indicate that LGMN deficiency impaired post-MI inflammation resolution.

10. Depletion of Lgmn in Resident Cardiac Macrophages Exacerbates Cardiac Function After MI

組織原位巨噬細胞特異性敲除Lgmn (Lgmn^F/F×Cx3cr1^CreER)锋边，MI14天后心功能更差，梗死灶面積更大编曼，心肌細胞凋亡更多豆巨，巨噬對凋亡心肌的清除減少。

11. Lgmn Overexpression in Cardiac Macrophages Improves Cardiac Function in Mice After MI

最后掐场，作者給使用Lgmn的AAV干預(yù)了Lgmn KO 鼠往扔。結(jié)果顯示重新表達Lgmn后，MI小鼠心功能改善熊户，梗死灶減小萍膛，心肌凋亡細胞減少，巨噬對凋亡心肌的吞噬增強嚷堡。此外蝗罗，AdLgmn原位巨噬展示出增強的 high-burden efferocytosis 和增加的 phagocytic capacity。

參考文獻：

1. 文獻學(xué)習(xí)094--自我更新的心臟組織原位巨噬細胞限制心梗后的adverse remodeling
2. 文獻學(xué)習(xí)015--[sc]心臟原位巨噬細胞抑制纖維化和刺激血管生成