我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質(zhì)粒的骨架及其各個(gè)要素的介紹：
解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒
簡單梳理就是質(zhì)粒大框架+小元件：大框架包含質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)欢揖，啟動子议蟆，表達(dá)元件以及篩選標(biāo)記奴拦，為了達(dá)到特定目的或細(xì)化功能棺弊，需要引入帶有各種功能的小元件僚楞，而所有達(dá)成這個(gè)目的質(zhì)粒元件拼湊行為，我們統(tǒng)稱之為質(zhì)粒重組。接下來我們會介紹幾種常用的質(zhì)粒克隆技術(shù)氛魁。

今日我們從最傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建方法--限制性克隆開始說。

質(zhì)粒命名

在開始之前我們簡單講一下質(zhì)粒命名。質(zhì)粒命名雖沒有明確的規(guī)則秀存，但也有一些約定俗成的命名習(xí)慣捶码，可以幫助人們快速識別質(zhì)粒特性。

1. 小寫p開頭 或链，p在這里指代質(zhì)粒（plasmid）惫恼，所以我們常常看到pXXXXX-XXXX澳盐。

2. 質(zhì)粒骨架 p后面接上質(zhì)粒骨架名稱祈纯，pBACKBONE-XXXX。質(zhì)粒骨架中包含promoter等等重要信息洞就，一旦你對這個(gè)骨架熟悉盆繁，通過名稱則很快能推測出質(zhì)粒元件掀淘。addgene有專門的Vector Database可供查閱許多已發(fā)表或商業(yè)化的質(zhì)裂空骨架信息。

3. 插入的基因名革娄，pBACKBONE-hGene倾贰，可以看到h在這里的意思是human。在質(zhì)粒命名中經(jīng)常會用小寫字母來代替物種拦惋，小鼠m匆浙，大鼠r等等。對于Cas9會寫SpCas9厕妖，Sp則意為 Streptococcus pyogenes （化膿性鏈球菌）首尼。

4. 貼Tags，通常插入的基因還會帶有flag言秸，需要按照出現(xiàn)順序給出信息软能，比如我們前面文章提到的NLS-Cas9-NLS，這意味著Cas9前后各有一個(gè)核定位信號NLS举畸，以保證Cas9的和核定位查排。

5. 標(biāo)記突變信息，插入的基因時(shí)常帶有特定突變抄沮，因此需要額外標(biāo)記出來跋核。而突變通常使用氨基酸表示，如Q295A代表：第295位谷氨酰胺（Glutamine）突變?yōu)楸彼?（Alanine）叛买。

以上是質(zhì)粒命名的一些通用規(guī)則砂代，有時(shí)候質(zhì)粒不一定嚴(yán)格按照以上規(guī)則命名，但可以舉一反三率挣，窺得其中一些規(guī)律刻伊。

例子：

(1) pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)：以PX458為骨架，帶有SpCas9表達(dá)元件，SpCas9后連接有2A-GFP元件娃圆，2A用于自我斷裂玫锋，將Cas9和GFP分開，而GFP則作為篩選標(biāo)記讼呢。

(2) px458_2A_GFP_sgRNA_TIAL1：以PX458為骨架（該骨架帶有SpCas9）撩鹿，帶有2A-GFP元件用于斷裂和篩選，同時(shí)表達(dá)針對TIAL1基因的sgRNA悦屏，因此該質(zhì)两诼伲可用于TIAL1基因敲除，并且可使用GFP篩選础爬。

(3) pLenti-U6sgbbBsmbI-puro-2A-Fluc：慢病毒骨架質(zhì)粒甫贯，帶有U6啟動子，奇怪名稱sgbbBsmbI（由于這是一個(gè)空骨架質(zhì)粒看蚜，盲推這是酶切位點(diǎn)叫搁？）的sgRNA，篩選標(biāo)記是puromycin供炎，同時(shí)還會有熒光素酶表達(dá)用于體內(nèi)成像渴逻。

限制性克隆

1. 簡介

限制性克隆是我們最常用的克隆技術(shù)，不僅操作便捷音诫，單位價(jià)格低廉惨奕，還特別好使。限制性克隆竭钝，顧名思義梨撞，即使用限制性內(nèi)切酶切開載體，并插入一段擁有適配酶切位點(diǎn)的片段香罐，如下圖：

RESTRICTION CLONING

2. 注意事項(xiàng)

在設(shè)計(jì)和進(jìn)行限制性克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)卧波，需要考慮以下幾點(diǎn)條件至少有以下幾點(diǎn)：

1. 最重要的是需要有合適的酶切位點(diǎn)。因此在選擇質(zhì)粒骨架的時(shí)候穴吹，我們偏愛那些具有多克隆位點(diǎn)（Multiple Cloning Site幽勒，MCS）的質(zhì)粒。當(dāng)然質(zhì)粒骨架有MCS還是不夠的港令，實(shí)驗(yàn)室還得儲備足夠多種類的酶啥容，可選擇的酶的緩沖液還需兼容。需要注意顷霹，限制性內(nèi)切酶可產(chǎn)生粘性末端或平端咪惠，由于平端末尾會對末端原始序列造成改變，由此可能使得翻譯區(qū)出現(xiàn)移碼突變等淋淀，且平端的連接通常難度更大遥昧，因此能選粘性末端絕不選擇平端。我們有經(jīng)常為酶切位點(diǎn)的貧瘠而跳腳，因?yàn)槊妇彌_液不兼容而不得不分開酶切的經(jīng)歷炭臭。這個(gè)問題需要靠運(yùn)氣和財(cái)力解決永脓。

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2. 最好是插入片段本身就有適配的酶切位點(diǎn)。如若沒有鞋仍，則可以設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的Primer常摧，通過PCR擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的插入片段。當(dāng)然在設(shè)計(jì)primer上的酶切位點(diǎn)時(shí)威创，記得加入幾個(gè)保護(hù)堿基落午。擁有適配酶切位點(diǎn)的情況不多，大多數(shù)情況我們受限于骨架質(zhì)粒以及插入片段沒有適配的酶切位點(diǎn)肚豺，通過PCR的方式人為加入酶切位點(diǎn)是很常見的解決方式溃斋。除此之外，還可以將插入片段連接到一個(gè)擁有MCS的中間質(zhì)粒吸申，而中間質(zhì)粒的MCS則包含骨架質(zhì)粒所需的酶切位點(diǎn)梗劫，通過酶切中間質(zhì)粒曲線救國。

3. 為保證足夠多的連接材料呛谜，骨架質(zhì)粒和插入片段的起始原料要足夠多在跳，在只做一次插入連接的情況下，我們一般會選擇至少2 μg的骨架質(zhì)粒在2x50 μL體系中進(jìn)行酶切隐岛，最后進(jìn)行凝膠電泳回收（以下簡稱“膠回收”）純化。在實(shí)際試驗(yàn)過程中瓷翻，骨架質(zhì)粒以及插入片段的酶切產(chǎn)物是越多越好聚凹，因?yàn)槲幢啬芤淮芜B接成功，重來的概率不低齐帚。為解決這個(gè)問題妒牙，可以選擇使用更大的酶切體系以獲得更多的原材料，同時(shí)原材料的酶切要盡可能完全对妄。

4. 保證所有的原材料“干凈”湘今，為長遠(yuǎn)計(jì)，我們建議所有的初始原材料最好都經(jīng)過膠回收進(jìn)行純化剪菱。

5. 去磷酸化防止載體自連摩瞎。載體自連容易發(fā)生在載體酶切后的末端是平端或互補(bǔ)時(shí)。由于連接酶連接載體時(shí)孝常，需要有5’磷酸基和3‘-OH的存在才可環(huán)化旗们。因此可以在酶切后使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基，這個(gè)過程也叫做末端鈍化（blunting）构灸。目前常用的有 小牛堿性磷酸酶（calf alkaline phosphatase上渴，CIP）和蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP） 。

   5'磷酸基-3'OH

6. 末端磷酸化幫助克隆連接稠氮。在DNA連接步驟曹阔，骨架質(zhì)粒和插入片段都需要有5‘磷酸基。去磷酸化的骨架質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物都需要進(jìn)行5’磷酸化隔披。在這里常用T4多核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase次兆，T4 PNK ）對 5’端重新磷酸化。

3. 案例分析

在SnapGene等相關(guān)軟件中锹锰，我們可以很好的模擬限制性克隆的過程（也不是所有過程都可以模擬）芥炭，我們以以下為例，舉例一個(gè)不太常規(guī)的限制性克隆實(shí)驗(yàn)恃慧。

3.1 目的：更換mCherry為DsRed(FRT)GFP元件

aim

如上圖所示园蝠，插入片段兩端的酶切位點(diǎn)和骨架質(zhì)粒酶切位點(diǎn)并不兼容。在這種情況下痢士，我們可以將左側(cè)質(zhì)粒的DsRed(FRT)GFP片段插入到一個(gè)包含MCS的中間質(zhì)粒彪薛，再利用中間質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)與骨架質(zhì)粒酶切位點(diǎn)兼容。

3.2 設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)過程

因?yàn)橛X得插入中間質(zhì)粒有點(diǎn)麻煩怠蹂，所以我們決定設(shè)計(jì)使用PCR擴(kuò)增DsRed(FRT)GFP片段并在primer末尾加入酶切位點(diǎn)善延，具體設(shè)計(jì)如下：

design

實(shí)驗(yàn)過程如下：

（1）設(shè)計(jì)PCR 引物，并在primer末端加入BsrGI酶切位點(diǎn)于GFP元件末端城侧，同時(shí)在酶切位點(diǎn)外部加入4個(gè)保護(hù)堿基易遣。常規(guī)情況下，左側(cè)還應(yīng)該再重構(gòu)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)嫌佑，然而因?yàn)楣羌苜|(zhì)粒中我們選擇的HpaI酶切位點(diǎn)產(chǎn)生的是平端末尾豆茫，因而左側(cè)不再重構(gòu)酶切位點(diǎn)。對DsRed(FRT)GFP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切并膠回收屋摇。

primer design

（2）對骨架質(zhì)粒66.2272.CAG.mCherry進(jìn)行HpaI+BsrGI兩步酶切（因?yàn)閮煞N酶的buffer不兼容）揩魂。可選擇對酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化（當(dāng)時(shí)并沒有做）炮温。

（3）使用T4連接酶連接→→感受態(tài)轉(zhuǎn)化→→涂平板火脉、挑菌落、質(zhì)粒提取柒啤、測序驗(yàn)證倦挂、轉(zhuǎn)染驗(yàn)證。

結(jié)果如下：

result

最后

構(gòu)建質(zhì)粒各種步驟白修、各種困難妒峦，下面我們提供一個(gè)一步到位的辦法，那就是：

買買買

相信大家都曾有過或現(xiàn)在都還有的一種想法（包括我自己）兵睛，那就是作為博士生肯骇，你必須什么都會窥浪，凡事都要親力親為，不要想著買（尤其PI）笛丙⊙總覺得這個(gè)實(shí)驗(yàn)如果通過付費(fèi)輕輕松松就達(dá)成，你不配被稱為博士生胚鸯。

在目標(biāo)質(zhì)粒是可獲取的（尤其Addgene上質(zhì)粒很便宜）骨稿，還是要自己折騰個(gè)十天半個(gè)月，成功就還罷了姜钳，不成功的話還需要各種解決bug坦冠，花費(fèi)大量的精力和試劑耗材在質(zhì)粒構(gòu)建上，也不過是做出了一個(gè)工具哥桥，與課題進(jìn)度甚至無關(guān)辙浑，仔細(xì)算下來，還不如直接購買質(zhì)粒劃算拟糕。本人現(xiàn)在有一種感覺判呕，質(zhì)粒就抗體一樣（畢竟大部分實(shí)驗(yàn)室不會想要自己做抗體，不排除一些實(shí)驗(yàn)室自己有實(shí)力送滞，也是自己做的）侠草，不一定非要自己構(gòu)建，除非非常簡單或沒得選擇犁嗅。