類器官（Organoid / Patient Derived Organoid, PDO）是經(jīng)過體外3D培養(yǎng)痢掠，通過細(xì)胞自組裝形成的微型三維細(xì)胞聚集體需曾，它可以在很大程度模擬人體同類組織或器官的遺傳特征和表觀特征。作為一種新興的前沿技術(shù)，類器官在人體組織器官的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)濒生、生理和疾病機制、精準(zhǔn)醫(yī)療幔欧、再生醫(yī)學(xué)罪治、藥物篩選等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。
目前研究人員傾向于使用體外模型進行藥物篩選和評估礁蔗。除了避免動物實驗的倫理問題觉义，還可以縮短研究周期并降低成本，構(gòu)建適當(dāng)?shù)捏w外模型能準(zhǔn)確地反映體內(nèi)環(huán)境浴井，并在此基礎(chǔ)上可以準(zhǔn)確反映目的藥物的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)晒骇。
但在類器官實際構(gòu)建過程中，我們或多或少會遇到一些問題磺浙，比如新構(gòu)建的類器官長不起來洪囤，如何模擬體內(nèi)環(huán)境，如何避免污染這些都是許多科研人想要解決的問題屠缭。
構(gòu)建成功的類器官三個因素：
1.?組織樣本：包括組織活性強度箍鼓，組織量的大小崭参，保存和運輸條件呵曹。
2.?培養(yǎng)試劑：包括組織消化酶的選擇，類器官培養(yǎng)基。
3.?操作手法：包括原代剪切手法和消化程度的辨別奄喂。
這幾個因素決定我們是否能培養(yǎng)出類器官铐殃，類器官的量是多還是少。
1. 組織樣本
由于組織活性不足而導(dǎo)致構(gòu)建失敗占了80%以上跨新，我們在臨床取樣的時候更傾向于去取癌旁富腊，癌組織邊緣，因為這個部位的癌干細(xì)胞侵襲性強域帐，活性比較高赘被。往往經(jīng)過了化療或者放療的患者的癌組織中間，纖維化肖揣，鈣化程度較高民假，中心壞死細(xì)胞比較多，癌干活性低龙优，不適合用于構(gòu)建類器官羊异。因此建議取未經(jīng)化療或者放療的組織，轉(zhuǎn)移性的癌組織也比較適合彤断。例如要分離肝癌類器官野舶，如果到手的組織是白色豆腐腦狀，癱軟宰衙，發(fā)黑平道，這種組織不適合，因為由于肝癌增長過快供炼，中心會因為缺血巢掺，缺營養(yǎng)導(dǎo)致組織壞死。一個好的肝癌樣本劲蜻，應(yīng)該是組織邊緣完整陆淀，沒有糜爛的現(xiàn)象，色澤呈淺紅或稍稍泛白先嬉。我們在鏡下也可以將組織剪碎后放到皿中初步觀察轧苫，假如鏡下除了雜質(zhì)外，都沒有幾個細(xì)胞疫蔓，或者細(xì)胞發(fā)黑含懊，碎片多，這種是肯定不適合構(gòu)建類器官的衅胀。一個好的樣本在鏡下初步觀察可以看到許多圓形細(xì)胞岔乔，在經(jīng)過消化后，會呈現(xiàn)出多個細(xì)胞團滚躯。
第二個組織量的大小也有要求雏门，一般手術(shù)樣本的大小嘿歌，至少有黃豆大小，如果樣本很大茁影，建議取腫瘤邊緣的組織（非纖維化宙帝、非鈣化、非壞死的組織）募闲，各個方向（上下左右）都建議取一塊步脓。如果是穿刺樣本，建議至少要2cm以上浩螺，手術(shù)樣本和穿刺樣本都需要浸沒到組織保存液中進行4℃低溫運輸靴患。如果是新鮮的胸腹水，需要至少50mL的體積要出，并低溫運輸蚁廓。時間控制在48小時以內(nèi)，越早做成功率越高厨幻。
2. 培養(yǎng)試劑
組織消化液的選擇非常關(guān)鍵相嵌，如果用膠原酶Ⅱ、膠原酶Ⅳ况脆，那么消化時間比較長饭宾，消化時間越長細(xì)胞活性越低。類器官的培養(yǎng)實際上是在培養(yǎng)成體干或者腫瘤干格了，這些干細(xì)胞的培養(yǎng)是要比普通原代提取是要難的看铆，消化效果太強，干細(xì)胞活性受損盛末，消化效果太弱弹惦，消化時間長對干細(xì)胞活性也不好，最好將消化時間控制在15-30分鐘悄但，對于比較硬的組織棠隐，例如肝膽管癌、食管癌檐嚣，消化時間需要控制在1個小時以內(nèi)助泽。
第二個是培養(yǎng)基的選擇，培養(yǎng)基的因子很多嚎京，如果按某一個文獻的配方來做嗡贺，這個配方可能有所保留，可能也養(yǎng)不好鞍帝，需要結(jié)合多篇文獻來摸索诫睬，但這個耗費的時間精力是巨大的，目前有商業(yè)化的培養(yǎng)基可供科研人選擇帕涌，這些培養(yǎng)基是為研究某種類器官特定摸索研究得到的摄凡，可以節(jié)省科研人的時間成本续徽。
3.?操作手法
類器官的原代提取的流程
組織清洗：在收到新鮮組織樣本后，需要用原代緩沖液清洗3-5次以去除樣本表面血液架谎，在放入4℃預(yù)冷的組織保存液中保存運輸。（如果樣本前期保存不當(dāng)會導(dǎo)致細(xì)胞活性差辟躏、污染谷扣、正常細(xì)胞少等問題，降低構(gòu)建成功率捎琐。）接著將組織轉(zhuǎn)移至潔凈實驗室進行組織處理和細(xì)胞分離会涎，拍照并登記信息。準(zhǔn)備多個60mm培養(yǎng)皿瑞凑，往培養(yǎng)皿中加入4℃預(yù)冷的原代緩沖液備用末秃。將組織放入培養(yǎng)皿中，原代緩沖液清洗3-5次籽御，洗去雜質(zhì)练慕。
剪切：使用眼科剪或手術(shù)刀將組織切割成體積約為1~3mm的組織塊（建議放入1.5mL EP管剪碎組織）。對于較硬的組織可以剪得更細(xì)一點技掏，更利于消化铃将。組織在剪完以后也是會有細(xì)胞團的，不一定非要等到消化后在看哑梳，我們剪切好組織后劲阎，可以取樣在顯微鏡下初步判斷樣本的好壞。
消化：接著進行消化鸠真，往剪碎后的組織塊中加入3mL（約組織體積3-5倍體積）的原代組織消化液（多加一點也沒有關(guān)系）悯仙，37℃搖床中震蕩消化，消化過程中隨時觀察組織消化情況吠卷。10分鐘后取少量消化液在顯微鏡下觀察锡垄，當(dāng)在鏡下觀察到較多的細(xì)胞簇或單個細(xì)胞后，加入3倍體積原代緩沖液終止消化祭隔，如果沒有出現(xiàn)大量的細(xì)胞團偎捎，則繼續(xù)消化。一般消化好后可以看到液體變渾濁序攘。
過濾：終止消化后將所有液體通過100μm孔徑的篩網(wǎng)過濾，將細(xì)胞濾液置于離心機中以300g離心5分鐘程奠，棄去上清丈牢，加入原代緩沖液再次重懸，再次300g離心5分鐘后棄去上清瞄沙。如果在這一步?jīng)]有出現(xiàn)細(xì)胞沉淀己沛，可能是由于離心力不夠慌核，或者是在過濾的時候細(xì)胞團沒有吹下來，可以用多一點的緩沖液多次沖洗篩網(wǎng)上的細(xì)胞團申尼，還有可能是離心結(jié)束后棄上清的時候直接倒掉了垮卓，一般建議用槍慢慢地把上清棄去，還有可能是沒有消化好师幕。如果細(xì)胞沉淀含有紅細(xì)胞粟按，棄上清后加入1mL紅細(xì)胞裂解液，裂解1-2分鐘后稀釋至10mL霹粥，再次以300g離心5分鐘灭将。紅細(xì)胞的存在會不利于類器官的觀察，當(dāng)紅細(xì)胞量少時也可ui不進行裂紅后控。
點膠加液：盡量去除上清庙曙，觀察收集到的細(xì)胞沉淀體積量，添加25倍細(xì)胞沉淀體積的基質(zhì)膠重懸（基質(zhì)膠提前1天放4度冰箱融化浩淘，點膠時再把基質(zhì)膠拿出來）充分混勻捌朴，并置于冷凍管架上保持0-4℃≌懦基質(zhì)膠對溫度比較敏感男旗，從加膠點樣的時間需要把控，還有用基質(zhì)膠重懸細(xì)胞團的時候欣鳖，重懸的時間太久察皇，會吹出很多氣泡，而這些氣泡會黏附在耗材上泽台，會使類器官丟失什荣。以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點25-30 μL組織基質(zhì)膠混合物進行鋪板怀酷。放入37℃培養(yǎng)箱中15-30分鐘稻爬，等待基質(zhì)膠凝固。每孔加750μL恢復(fù)至室溫或預(yù)熱的類器官培養(yǎng)基蜕依，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)桅锄。
原代操作過程中，要注意無菌操作样眠，并確保使用的耗材無菌友瘤，使用的剪刀鑷子需要進行高壓滅菌，沒有高壓滅菌條件也要用酒精燈灼燒檐束，用酒精棉球進行擦拭辫秧；運輸過程中可以往組織保存液中加入1%PS。如果不幸出現(xiàn)污染被丧，這個孔的類器官是一定要舍棄的盟戏。
