從生物體取出組織或器官克蚂，經(jīng)酶的消化或其他方法得到單個(gè)細(xì)胞，并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞瞻赶，稱為原代細(xì)胞赛糟。原代細(xì)胞壽命和代次有限，培養(yǎng)條件需根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化砸逊，它與生物相關(guān)性高璧南，保留體內(nèi)組織遺傳特性。使用原代細(xì)胞能避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面的倫理學(xué)異議师逸，盡管減少了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成本司倚，但原代細(xì)胞的分離和成本還是很高，在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中我們希望盡量減少異常問題的發(fā)生篓像。一般問題主要有細(xì)胞漂浮动知、不貼壁、生長緩慢等問題遗淳，大部分可以從消化傳代拍柒、培養(yǎng)基的使用心傀、細(xì)胞污染方面考慮屈暗。
一、細(xì)胞漂浮
1. 操作不當(dāng)導(dǎo)致貼壁性差或細(xì)胞本身貼壁性不強(qiáng)
解決方法：PLL脂男、膠原养叛、0.1%明膠包被，可增強(qiáng)細(xì)胞吸附性宰翅。
2. 培養(yǎng)器皿：材料表面吸附能力不足
解決方法：使用特殊處理的培養(yǎng)材料弃甥。
3. 細(xì)胞對(duì)溫度敏感、預(yù)冷收縮
解決方法：將環(huán)境維持在25℃以上汁讼，培養(yǎng)溫度維持在37℃淆攻，細(xì)胞換液傳代過程中預(yù)熱培養(yǎng)基阔墩。細(xì)胞停留在培養(yǎng)箱外的時(shí)間不能太長，盡量減少拿出拿進(jìn)培養(yǎng)箱的次數(shù)瓶珊。
4. 血清濃度低啸箫、培養(yǎng)液中貼壁因子較少
解決方法：增加血清量，血清含量不低于5%伞芹。當(dāng)然也有部分不需要加血清的細(xì)胞忘苛，或者加了血清會(huì)促進(jìn)分化的細(xì)胞，不適合提高血清濃度唱较。?
5. 運(yùn)輸導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)脫落
解決方法：保證運(yùn)輸溫度在25℃以上扎唾，包好緩沖棉減少震蕩。溫度低南缓，加暖寶寶胸遇，溫度高加冰袋。
二汉形、細(xì)胞傳代不貼壁
1. 細(xì)胞脆弱狐榔、易受損傷，傳代過程中吹打離心消化
解決方法：
（1）控制處理過程获雕，4℃或者使用溫和的消化酶消化薄腻，減少損傷
（2）盡量避免消化后的細(xì)胞直接用于實(shí)驗(yàn)（可能還有消化酶的殘留）
2. 酶消化對(duì)細(xì)胞表面蛋白損傷
解決方法：降低酶濃度0.05%或者不使用胰酶。
3. 缺少細(xì)胞外基質(zhì)届案，吸附性不強(qiáng)
解決方法：1）包被接種庵楷，PLL、膠原楣颠、明膠纖粘蛋白等尽纽。2）使用特殊處理材料培養(yǎng)。
4. 誘發(fā)細(xì)胞凋亡童漩、漂浮
解決方法：更換培養(yǎng)液（培養(yǎng)液配制弄贿、儲(chǔ)存不當(dāng)，如pH值過堿矫膨，Gln量太少等原因）差凹、調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)、添加抑制凋亡試劑侧馅，比如ROCK 抑制劑等危尿。
5. 傳代比例過大，接種細(xì)胞數(shù)目太少馁痴，無法分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)
解決方法：推薦傳代比例1傳2谊娇，細(xì)胞傳代24小時(shí)之內(nèi)，最好不要晃動(dòng)罗晕，以免影響貼壁济欢。
三赠堵、其他常見問題
Q1：如何判斷原代細(xì)胞衰老了？
A：(1）形態(tài)學(xué)的觀察法褥，細(xì)胞突起變大顾腊、或細(xì)胞扁平；
? ? ?(2）β半乳糖苷染色判斷細(xì)胞是否衰老挖胃；
? ? ?(3）增殖速率明顯下降杂靶；
? ? ?(4）對(duì)相關(guān)的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。
Q2：如何確保分離的原代細(xì)胞的活性
A：(1）組織離體時(shí)間不能太久酱鸭；
? ? ?(2）低溫冰上分離吗垮，但也不能直接從-80℃冰箱上取出一塊冰；
? ? ?(3）無菌操作體系凹髓；
? ? ?(4）消化酶的濃度和消化時(shí)間的把控烁登。
Q3：如何讓原代細(xì)胞一直保持增殖能力？
A：原代細(xì)胞傳代有限蔚舀，我們可以通過構(gòu)建永生化細(xì)胞株使其獲得無限增殖的能力饵沧，即轉(zhuǎn)變?yōu)橛郎?xì)胞系。
Q4：原代細(xì)胞一般第幾代做實(shí)驗(yàn)比較好赌躺？
A：5代以內(nèi)狼牺，3代最好。
Q5：原代細(xì)胞可以凍存嗎礼患？凍存復(fù)蘇后活率差的原因是什么是钥？
A：這取決于細(xì)胞的類型。一些細(xì)胞類型像神經(jīng)細(xì)胞缅叠，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和一些生長緩慢的上皮細(xì)胞悄泥，不推薦擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。其它的細(xì)胞類型像成纖維細(xì)胞肤粱、星形細(xì)胞弹囚、腎系膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等领曼，可以擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存鸥鹉。然而，需要注意的是再次凍存的過程可能導(dǎo)致細(xì)胞生長性能的改變悯森。凍存后復(fù)蘇活率低需要考慮凍存前細(xì)胞活性宋舷，細(xì)胞量以及凍存體系绪撵，凍存體系是指用的含血清的凍存液瓢姻，還是一步凍存液，不同凍存方法對(duì)應(yīng)的操作方法不同需要注意音诈。
Q6：貼壁的原代細(xì)胞很難消化是怎么回事幻碱？
A：細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)在細(xì)胞皿上培養(yǎng)的時(shí)間過長绎狭，解決方法可以將酶的濃度降低，37℃培養(yǎng)箱中延長消化時(shí)間褥傍，或者分步消化儡嘶。
Q7：提取原代細(xì)胞經(jīng)常發(fā)生污染可以怎樣改善？
A：首先要確保細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)室是否存在細(xì)菌污染恍风，如果存在問題蹦狂，需要將實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒，培養(yǎng)箱滅菌朋贬，檢查試劑耗材是否可用凯楔，第二個(gè)就是注意無菌操作，保證試劑锦募、剪刀鑷子等無菌摆屯，第三是可以在培養(yǎng)液中加抗生素，雙抗糠亩、兩性霉素等虐骑。
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