一 基礎知識
1、什么是富集分析缘回？
富集分析的原理
一個生物過程通常是由一組基因共同參與起便，而不是由單個基因獨自完成。富集分析的基本前提假設是狞洋，如果一個生物學過程在已知的研究中發(fā)生異常弯淘，則共同發(fā)揮功能的基因極可能被選擇出來作為一個與這一過程相關的基因集合。
富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）通常是分析一組基因在某個功能節(jié)點上是否相比于隨機水平過于出現（over-presentation）吉懊。富集分析原理可以由單個基因的簡單注釋擴展到多個基因集合的成組分析庐橙。
2、富集分析能用來干什么借嗽？
富集分析的作用态鳖。一組基因直接注釋的結果是得到大量的功能節(jié)點，這些功能具有概念上的交疊現象恶导，導致分析結果冗余浆竭，不利于進一步的精細分析，所以研究人員希望對得到的功能節(jié)點加以過濾和篩選，以便獲得更有意義的功能信息兆蕉。目前最常用的方法是基于GO和KEGG的富集分析羽戒。首先通過多種方法多的大量的感興趣的基因，例如差異表達基因集虎韵、共表達基因模塊易稠、蛋白質復合物基因簇等，然后尋找這些感興趣基因集顯著富集的GO節(jié)點或者KEGG通路包蓝，這有助于進一步深入細致的實驗研究驶社。總而言之测萎，富集分析是用來解讀一組基因背后所代表的生物學知識亡电，揭示其在細胞內或細胞外扮演了什么樣的角色。
富集分析中常用的統計方法有累計超幾何分布硅瞧、Fisher精確檢驗等份乒。由于在進行富集分析時通常需要同時進行大量檢驗（多重檢驗），所以需要采用多重檢驗校正的方法對檢驗結果進行校正腕唧，常用的校正方法包括Bonferroni校正或辖、Benjiamini false discovery rate校正。利用富集分析方法枣接，對基因注釋數據庫做生物信息學研究產生了很多富集分析工具颂暇，例如DAVID在線分析工具、R clusterProfiler包但惶、Metascape等耳鸯，這些工具對促進基因功能分析以及研究高通量測序技術產生的生物學知識數據發(fā)揮了關鍵作用。因為網絡上相關的教程有很多膀曾，本初不再贅述县爬，大家可以自行檢索，文末列舉了幾個小編認為適合上手的教程添谊。
3捌省、富集分析有幾種類型？
依據富集分析過程中基因選擇碉钠、注釋數據庫的不同，常用的富集分析可以分為以下四種類型：GO term功能富集卷拘、KEGG pathway通路富集喊废、MSigDB基因集富集和單基因富集等等。
(1) GO term功能富集
基因本體（gene ontology栗弟， GO）數據庫是GO組織在2000年構建的一個結構化的標準生物學模型污筷，涵蓋了細胞組分、分子功能、生物學過程三個方面瓣蛀，是目前應用最廣泛的基因注釋體系之一陆蟆。GO的注釋體系是一個有向無環(huán)圖，包含三個分支惋增，注釋系統中每一個節(jié)點都是基因或蛋白質的一種描述叠殷，節(jié)點之間保持嚴格的“父子”關系。因此诈皿，一個基因或蛋白質可以從三個層面得到注釋林束。
(2) KEGG pathway通路富集
京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）是系統分析基因功能、基因組信息的數據庫稽亏，整合了基因組學壶冒、生物化學及系統功能組學的信息，有助于研究者把基因及表達信息作為一個整體進行研究截歉。目前KEGG共包含了19個子數據庫胖腾，富集分析常用在KEGG Pathway通路中。
(3) MSigDB 基因集富集
MSigDB數據庫定義了已知的基因集合瘪松，包括H和C1-C7八個系列（Collection）咸作。H: hallmark gene sets （效應）特征基因集合，共50組凉逛；C1: positional gene sets 位置基因集合性宏，根據染色體位置，共326個状飞；C2: curated gene sets：（專家）共識基因集合毫胜，基于通路、文獻等诬辈，包括KEGG酵使；C3: motif gene sets：模式基因集合，主要包括microRNA和轉錄因子靶基因兩部分焙糟；C4: computational gene sets：計算基因集合口渔，通過挖掘癌癥相關芯片數據定義的基因集合；C5: GO gene sets：Gene Ontology 基因本體論穿撮；C6: oncogenic signatures：癌癥特征基因集合缺脉，大部分來源于NCBI GEO 未發(fā)表芯片數據；C7: immunologic signatures: 免疫相關基因集合悦穿」ダ瘢可以從中獲取大量的已知基因集合從而進行富集分析。
(4) 單基因富集
單基因富集分析并不是說拿單個基因來進行富集分析栗柒，一個基因根本沒法進行統計檢驗礁扮。而是基于單個基因來抓取與其相關的基因，然后用這些相關的基因來進行功能富集，有兩種方法：差異法和相關法太伊。
差異法：根據給定的一個基因的表達值對樣本進行分組雇锡，然后計算組間的差異表達基因，進而利用差異基因進行富集分析僚焦。
相關法：計算給定的一個基因的表達值與其他基因之間的相關性锰提，將具有顯著相關的基因作為一個集合進行富集分析。
功能分析（functional analysis）/ 通路分析（pathway analysis）是將一堆基因按照基因的功能/通路來進行分類叠赐。換句話說欲账，就是把一個基因列表中，具有相似功能的基因放到一起芭概，并和生物學表型關聯起來赛不。GO分析是將基因分門別類放入一個個功能類群，而pathway則是將基因一個個具體放到代謝網絡中的指定位置罢洲。
需要注意的是踢故，不同數據庫覆蓋的基因數目是不一樣的，以human為例惹苗，一共2萬多個蛋白編碼基因 殿较， 其中有KEGG pathway注釋的只有6000多個。由于已有認知的缺陷桩蓉，這個是無法避免的問題淋纲，只能通過不斷的探索研究來更新和完善數據庫中的內容。
4院究、統計方法
如何研究差異基因集中參與的生物學過程洽瞬，需要借助統計學手段，常見的方法包括以下兩種：
- 費舍爾精確檢驗
- GSEA
費舍爾精確檢驗的核心就是得到如下所以的2X2的表格业汰，
DGE Genome
in pathway 19 40
not in pathway 281 6800
從兩個角度將基因進行分類伙窃，是否為差異基因，是否位于待研究的通路上样漆，就可以得到上述表格了为障。第一列之和為差異基因的總數，第二列之和為非差異基因的總數放祟。
在用這種方式進行分析時鳍怨，通常會選擇一個log2FD的閾值，挑選顯著差異的基因跪妥，這種一刀切的過濾手段去除了一些可能的關鍵基因京景，其次，如果你的差異基因沒有對應的pathway注釋骗奖，那么在富集分析時，會被直接丟掉，以上兩點是這種方法的缺陷执桌。
GSEA又稱之為基因集富集分析鄙皇，這里的基因集指的就是數據庫中的基因集合，比如pathway中的某條通路對應的所有基因仰挣，所以這種方法的研究對象和費舍爾精確檢驗是一致的伴逸。唯一不同的是，它的輸入是所有基因膘壶，首先對基因進行排序错蝴，然后分析排序后的基因列表在某個通路下是否富集。
由于該方法不需要對基因事先過濾颓芭，所以不會丟掉某些差異基因顷锰，能夠挖掘出的信息量也會增加，近年來也是越來越受歡迎亡问。
二 常用數據庫介紹
1. GO
GO數據庫是基因本體論聯合會（Gene Ontology Consortium）建立的一個數據庫（官網http://geneontology.org/）官紫，旨在建立一個適用于各種物種的、對基因和蛋白功能進行限定和描述的州藕，并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標準束世。分別從分子功能、參與的生物途徑及細胞中的定位對基因產物進行了標準化描述床玻，
GO注釋分為三大類毁涉，分別是：分子生物學功能（Molecular Function，MF）锈死、生物學過程（Biological Process贫堰，BP）和細胞學組分（Cellular Components，CC）馅精，通過這三個功能大類严嗜，對一個基因的功能進行多方面的限定和描述。一個基因對應有一個或多個GO term（GO功能）洲敢，一個term對應多個gene漫玄。
Cellular component解釋的是基因產物在哪里，在細胞質還是在細胞核压彭，如果存在細胞質那在哪個細胞器上睦优，如果是在線粒體中那是存在線粒體膜上還是在線粒體的基質中。
Biological process該基因參與了哪些生物學過程壮不，比如參與了rRNA的加工或參與了DNA的復制汗盘。
Molecular function該基因在分子層面的功能是什么，它是催化什么反應的询一。
通常在得到差異表達基因后隐孽，可通過功能富集分析進一步篩選對生物體具有重要意義的基因癌椿。將篩選得到的基因分門別類放入細胞組分CC、分子功能MF和生物過程BP三個功能類別中菱阵，基因產物被盡可能的富集到最低層的功能term上踢俄。尋找各個基因是否有共同的GO條目，或者有沒有共同的上級GO條目晴及，可以發(fā)現具有某些共同特點的基因都办。根據超幾何分布關系，GO分析會對涉及的GO返回一個p-value虑稼，小的p值表示差異基因在該GO 中出現了富集琳钉。GO 分析對實驗結果有提示的作用，通過差異基因的GO 分析蛛倦，可以找到富集差異基因的GO分類條目歌懒，尋找不同樣品的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關。
補充：
GO是Gene Ontology的縮寫胰蝠。本體論是哲學概念歼培，它是研究存在的本質的哲學問題。后來這個詞被應用到計算機界茸塞，定義為概念化的詳細說明躲庄。在實現上，一個ontology往往就是一個正式的詞匯表钾虐，其核心作用就在于定義某一領域或領域內的專業(yè)詞匯以及他們之間的關系噪窘，是領域內部不同主體之間進行交流的一種語義基礎。
使用GO的時候一般需要GO定義文件和GO關聯文件倔监。GO定義文件存放GO詞條的定義，而GO關聯文件則是不同命名體系與GO詞條的映射關系菌仁。條目標準定義：
id：GO編號浩习，如：GO:0031985
name：全稱，Golgi cisterna
ontology：命名空間namespace济丘，cellular_component
definition：定義谱秽，Any of the thin, flattened membrane-bounded compartments that form the central portion of the Golgi complex. Source: GOC:mah
條目之間的關系，采用有向無環(huán)圖（Directed Acyclic Graphs摹迷，DAG）的形式疟赊。注釋系統中每一個節(jié)點就代表了一個基本描述單元（term），有向指的是term之間的單向指向性關系峡碉，比如termA是內質網内颗，termB是細胞器蝗碎，規(guī)定A是B，卻不能說B是A；無環(huán)指的是從任何一點開始沿著規(guī)定的指向都不能回到原點项戴。
2. KEGG
KEGG是一個整合了基因組、化學和系統功能信息的綜合數據庫。KEGG下屬4個大類和17個子數據庫，而其中有一個數據庫叫做KEGG Pathway峡竣，專門存儲基因通路的信息，也是用的最多的一個量九，所以，久而久之颂碧，KEGG就被大家當做是一個通路數據庫了荠列。
GO分析好比是將基因分門別類放入一個個功能類群，而pathway則是將基因一個個具體放到代謝網絡中的指定位置载城。根據挑選出的差異基因肌似，計算這些差異基因同Pathway 的超幾何分布關系，Pathway 分析會對每個有差異基因存在的pathway 返回一個p-value诉瓦，小的p 值表示差異基因在該pathway 中出現了富集川队。pathway 分析對實驗結果有提示的作用，通過差異基因的Pathway 分析睬澡，可以找到富集差異基因的Pathway 條目固额，尋找不同樣品的差異基因可能和哪些細胞通路的改變有關。pathway 是蛋白質之間的相互作用煞聪，pathway 的變化可以由參與這條pathway 途徑的蛋白的表達量或者蛋白的活性改變而引起斗躏，因此pathway 分析的結果更顯得間接。
常見的富集結果描述包括：
RichFactor昔脯，富集因子啄糙，是指感興趣基因列表中屬于這個term的基因的數量/背景基因集中富集在這個term中所有基因的數量。
p值或q值：代表富集顯著程度云稚，可以映射到圖形顏色隧饼。
GeneNumber：感興趣基因列表中屬于這個term的基因數量。
Gene Percent(%)：感興趣基因列表屬于這個term的基因的數量占感興趣基因列表所有基因數量的百分比
三静陈、GO和Pathway富集分析的背景基因集
基因富集分析需要我們提供某一類功能基因的集合用于背景燕雁，常用的注釋數據庫如：
- The Gene Ontology Consortium: 描述基因的層級關系
- Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: 提供了pathway的數據庫。
功能(GO)或者通路(Pathway)富集分析時窿给，都會涉及到 Background; 做分析時贵白，分析工具會提供一些數據供使用者選擇或者使用自定義的gene list。
例如崩泡，在RNAseq或Microarray禁荒；有時候工具提供的 Background是物種所有的基因，現在也沒有同一的標準用來自己構建Background角撞。
兩個概念+例子
- Background frequency：Background 基因集包含注釋到某個GO term的基因數目呛伴。
- sample frequency：需要分析的gene 集包含注釋到某個GO term的基因數目勃痴。
一個例子，現有S. cerevisiae(現注釋有6442個基因)的10個基因需要做富集分析热康，如果這個10基因有5個基因注釋到了GO term-DNA修復(S. cerevisiae有100個基因注釋到DNA修復 )沛申；那么現在DNA修復的
- 背景頻率(background frequency)就是 100/6442；
- 樣本頻率(sample frequency)是 5/10姐军；
例子中铁材，10個基因是確定的；使用全基因組注釋的基因是6442奕锌；若是檢測中只檢測到5000個基因著觉，那么Background gene集選用5000，背景頻率也會變化(100 個DNA修復相關的基因都被檢測到了)惊暴，在統計檢驗時P值大小也會變化饼丘。除此之外，100 個DNA修復相關的基因也可能不會全部都在檢測結果中辽话。
GO term 或 Pathway 是否在實驗結果的差異基因集中富集常使用的統計學檢驗基于超幾何肄鸽、卡方或二項式分布∮推。基于基因組中基因注釋到某個GO term的概率不變典徘，查看差異基因集有多少基因可以注釋到同一個GO term，從而得到P值村砂。
Background 構造方法
1. 使用全基因組中所有的基因烂斋；部分軟件是這樣操作的
現在還沒有明確的證據說明某個基因在某個組織或細胞系中不表達；組織和細胞的狀態(tài)是動態(tài)變化的础废，基于不同的情況汛骂，基因表達模式也是不同的；在某個實驗中评腺，部分基因的表達可能會檢測不到帘瞭，但是他們還是背景的一部分。
使用全基因組中所有的基因蒿讥，背景頻率就會比較械睢；這種情況下得到的結果芋绸，p值也相比會小一些媒殉，假陽性也會增多。
2. Background應該包含可能是陽性結果的所有基因
在芯片測序中摔敛，特定的芯片也會對某一類的基因具有偏好性廷蓉；Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip中包含了更多與甲基化相關的芯片。
有的實驗目的是為了研究一定實驗條件下某個組織特定生物過程的富集狀況马昙。常規(guī)的操作是比較實驗和對照組的結果桃犬，通過差異表達的方法來鑒定組特異性表達的基因刹悴。陽性結果的蛋白或基因還是很難去鑒定了。
3. 實驗中攒暇，技術平臺能夠檢測到的基因土匀；(e.g., microarray)
在microarray實驗中，我們預先根據想要檢測的基因設計了芯片探針形用，因此所能檢測的基因是已知的就轧。但是一部分探針可能由于背景噪音的影響無法檢測到信號；這部分基因可以通過查閱先前已發(fā)表的的數據進行評估田度。
在RNAseq也存在各種問題會影響基因實際表達水平的測定钓丰，例如，PCR階段引物與序列之間的偏好性會引入不確定變化每币；為了避免技術和檢測上帶來的問題，人為設定基因表達的count閾值琢歇，移除低于閾值的基因或者只是丟棄在所有樣本中count都為零的基因兰怠。
四 富集分析工具
推薦clusterProfiler，它支持ORA和FCS兩類算法李茫。函數為：
- enrichGO, gseGO: GO富集分析揭保；
- enrichKEGG, gseKEGG: KEGG富集分析；
- enrichDAVID: DAVID富集分析魄宏；
GSEA
Gene Set Enrichment Analysis（基因集富集分析）用來評估一個預先定義的基因集S（已知功能的基因集）的基因在與表型相關度排序的基因列表L（按照logFC秸侣、Signal to Noise Ratio等排序的基因列表）中的分布趨勢（是隨機分布，還是主要分布在頂部或底部）宠互，從而判斷其對表型的貢獻味榛。GSEA確定一個預先定義的基因集是否能在兩個生物學狀態(tài)中顯示出顯著的一致性的差異，通俗一點就是某個通路/GO條目中的基因集在實驗組和對照組中呈現出一 致的上調或者下調趨勢予跌。
富集分數 enrichment score（ES）代表集合S在排序列表L的頂部或底部被過表達的程度搏色。這個分數是通過遍歷列表L來計算的，當我們遇到一個在S中的基因時增加一個running-sum statistic（類Kolmogorov-Smirnovlike統計量）券册，當遇到的基因不在S中時減少統計量频轿。增量的大小取決于基因統計（例如基因與表型的相關性）。ES為random walk中遇到的與零的最大偏差（maximum deviation from zero）烁焙。GSEA的那條曲曲折折的線就是通過不斷的加分減分做出來的航邢，圖中的每一條垂直線表示基因集S中一個基因。
利用置換檢驗（permutation test）計算ES的p值骄蝇。具體地說膳殷，我們對基因列表L的gene labels進行重新排列（permute），并為排列后的數據重新計算基因集的ES（重復1000次）乞榨，從而為ES生成一個null distribution秽之。然后相對于這個零分布計算觀察到的ES的p值当娱。并使用FDR調整計算q值。
各種方法的特點
ORA方法存在一些問題：僅使用了基因數目信息考榨，而沒有利用基因表達水平或表達差異值跨细，為了獲得感興趣或者差異表達基因，需要人為的設置閾值河质；ORA法通常僅使用最顯著的基因冀惭，而忽略差異不顯著的基因。在獲得感興趣的基因時, 往往需要選取合適的閾值, 有可能會丟失顯著性較低但比較關鍵的基因, 導致檢測靈敏性的降低掀鹅；假設每個基因都是獨立的散休，忽視了基因在通路內部生物學意義的不同（如調控和被調控基因的不同）及基因間復雜的相互作用；ORA假設通路與通路間是獨立的乐尊，但這個前提假設是錯誤的戚丸。
FCS方法相較于ORA 法在理論上有明顯突破，考慮到了基因表達值的屬性信息, 以待測基因功能集為對象來進行檢驗, 也使得檢驗結果更加靈敏扔嵌。認為雖然個體基因表達改變之后會更多在通路中體現限府，但是一些功能相關基因中較弱但協調的變化（small but consistent changes）也有明顯的影響。但是仍獨立分析每一條通路痢缎，
五胁勺、如何在SCI文章中實現高質量富集分析？
接下來從三篇SCI文章當中看一下如何將其應用独旷。
（一）富集分析揭示腫瘤亞型
2021年8月份發(fā)表在JCI Insight（IF=8.311）上的研究Key molecular alterations in endothelial cells in human glioblastoma uncovered through single-cell RNA sequencing署穗，從單細胞角度對膠質母細胞瘤中的內皮譜系細胞進行的降維、聚類嵌洼，識別到五個亞群案疲，通過計算亞群特異的差異表達基因，進而使用差異表達基因針對GO進行功能富集分析麻养，揭示了這5個亞群特異的生物學功能络拌，進而完成了膠質母細胞瘤的亞型區(qū)分，后續(xù)進行亞型刻畫及生存預后分析回溺。
（二）富集分析常見套路
2020年12月份發(fā)表在Medicine (Baltimore) （IF=1.880）的文章Screening and identification of key genes between liver hepatocellular carcinoma (LIHC) and cholangiocarcinoma (CHOL) by bioinformatic analysis春贸，從GEO數據庫搜索相關數據，一共找到三套數據遗遵，分別下載整理進行差異分析萍恕，對三套數據分析得到的差異基因取交集，一共得到170個差異基因车要，將上述得到的170個差異基因進行GO富集分析允粤、KEGG富集分析，揭示關鍵功能。后續(xù)進行hub基因識別类垫、生存分析驗證司光，足以發(fā)SCI文章。
（三）富集分析常見套路
2021年4月發(fā)表在Medicine (Baltimore)（IF=1.880）的文章Identification and analysis of key genes associated with acute myocardial infarction by integrated bioinformatics methods悉患。
基本思路是差異分析残家、GO和KEGG富集分析、PPI分析售躁、篩選hub基因坞淮。通過進行差異分析，分別從GSE66360成功鑒定出289個上調的DEG和62個下調的DEG陪捷。并且它們主要在富集在嗜中性粒細胞活化回窘，免疫反應，細胞因子市袖，核因子κB（NF-κB）信號通路啡直，IL-17信號通路和腫瘤壞死因子（TNF）信號通路。根據蛋白質間相互作用（PPI）的數據苍碟，對排名前10位的hub基因進行了排序付枫，包括白介素8（CXCL8），TNF驰怎，N-甲酰基肽受體2（FPR2）二打，生長調節(jié)型α蛋白（CXCL1）县忌，轉錄因子AP-1（JUN），白介素1β（IL1B）继效，血小板堿性蛋白（PPBP）症杏，基質金屬蛋白酶9（MMP9），toll樣受體2（TLR2）和高親和力免疫球蛋白ε受體亞基γ（ FCER1G）瑞信。此外厉颤，相關分析的結果表明，這10個hub基因之間存在正相關凡简。
建議學習材料
1.生物新信息學（人民衛(wèi)生出版社 李霞主編）
2.https://zhuanlan.zhihu.com/p/66005958[工具] 我比較喜歡的幾個富集分析工具（包括在線版和本地版）
3.https://zhuanlan.zhihu.com/p/135410211GO分析和KEGG分析都是啥逼友？
更多文獻解讀，知識概述請關注：文章 - 生信人 (biosxr.cn)
ref :
http://www.reibang.com/p/66eb3a16b296
http://www.reibang.com/p/3e102d928210
http://www.reibang.com/p/199b44974480
http://www.reibang.com/p/e6bad6f357cd
http://www.reibang.com/p/01d336679c38
http://www.reibang.com/p/3b9eee8c31cc
http://www.reibang.com/p/5cc889186bc5
http://www.reibang.com/p/b05359c51fe9
