對于科研工作者而言，我想“實(shí)驗(yàn)方案”這四個(gè)字應(yīng)該不會(huì)感到陌生吧茅郎！對于課題實(shí)驗(yàn)而言蜗元，一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)方案是成功的關(guān)鍵因素，會(huì)起到事半功倍的效果系冗。雖然只有簡短的四字奕扣，但有時(shí)候卻讓人焦頭爛額，不知道從何入手掌敬。小編不才惯豆，借此機(jī)會(huì)簡要的理一下思路，拋磚引玉奔害。如有“大趴蓿”經(jīng)過，煩請指點(diǎn)一二舀武。
目前拄养，生物醫(yī)學(xué)方向的研究熱點(diǎn)依然逃脫不了miRNA、lncRNA以及circRNA三大系列银舱，絕大部分都是與癌癥或腫瘤有關(guān)聯(lián)，在人體內(nèi)的作用機(jī)制還沒有得到完整的闡述跛梗，有待進(jìn)一步的深入研究寻馏。接下來本文以miRNA為例，來設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案核偿。
【隨便選取一個(gè)miRNA以及某種癌癥】----以miRNA-142-5p和肺癌為關(guān)鍵詞诚欠。
一、明確研究對象：miRNA-142-5p，肺癌轰绵。
有了這兩個(gè)對象還不夠粉寞，還缺少一個(gè)重要的因素，那就是miRNA-142-5p的靶基因左腔，因?yàn)閙iRNA一般都是通過作用靶基因來作用于癌癥唧垦。
1、靶基因預(yù)測
通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站液样，我們得知miRNA-142-5p的靶基因有很多振亮，這時(shí)小伙伴們是不是有個(gè)疑惑，這么多靶基因鞭莽，我該選哪個(gè)呢坊秸？不要慌，小編教你一個(gè)方法：因?yàn)橹黝}是與癌癥腫瘤相關(guān)澎怒，因此我們可以查找與cancer/tumor相關(guān)的靶基因褒搔。通過刷選，我們得知miRNA-142-5p的靶基因?yàn)镕AT3喷面、TP53INP1和TNFAIP3星瘾。
【靶基因預(yù)測網(wǎng)站：
microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)
和TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_61/)】
2、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測——驗(yàn)證預(yù)測的靶基因
二乖酬、對象明確后死相，接下來就要開始進(jìn)入正題了。咬像。（實(shí)驗(yàn)方法）
一般而言算撮，與腫瘤或癌癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法包括三部分：臨床實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（小鼠造模）县昂。
臨床試驗(yàn)
選取肺癌組織及其鄰旁健康組織（對照組）肮柜，通過RT-qPCR檢測組織內(nèi)miRNA-3156-5p的表達(dá)，以觀察miRNA-142-5p在肺癌組織中是高表達(dá)還是低表達(dá)倒彰。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
1审洞、細(xì)胞系
肺癌細(xì)胞系：H460、A549待讳、HCC827芒澜、H1975和H1299；正常肺上皮細(xì)胞系：BEAS-2B和HBE创淡。采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)痴晦。
2、VZET和EMT相關(guān)基因的表達(dá)情況分析
在肺癌細(xì)胞系和正常的肺上皮細(xì)胞系中利用RT-qPCR 和Western blot檢測miRNA-142-5p琳彩、FAT3誊酌、TP53INP1和TNFAIP3等相對表達(dá)量部凑。
3、轉(zhuǎn)染
以對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞/正常的肺上皮細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對象碧浊，轉(zhuǎn)染miRNA-142-5p（實(shí)驗(yàn)組）【實(shí)驗(yàn)組分為miRNA-142-5p過表達(dá)組（pc-miRNA-142-5p）和敲低組（siRNA）】涂邀，陰性對照組（siNC、pcNC)箱锐，以及空白對照組
【分為5組：siRNA比勉、pc -miRNA、siNC瑞躺、pcNC敷搪、Control group】。
其中關(guān)于敲低/沉默組（siRNA）幢哨，可以設(shè)計(jì)兩到三條對應(yīng)siRNA序列赡勘。
4、RT-qPCR和Western-blot
檢測轉(zhuǎn)染miRNA-142-5p后靶基因（FAT3捞镰、TP53INP1和TNFAIP3）的表達(dá)情況闸与。
5、轉(zhuǎn)染后要檢測miRNA-142-5p對細(xì)胞的影響岸售，論文中常見的一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞增殖践樱、遷移、侵襲凸丸、凋亡拷邢、自噬等，但各自采用的方法卻不一樣屎慢，接下來就簡單的介紹一下：
細(xì)胞增殖——MTT/MTS/CCK-8等實(shí)驗(yàn)瞭稼；
細(xì)胞遷移和侵襲——Transwell實(shí)驗(yàn)/劃痕愈合實(shí)驗(yàn)；
細(xì)胞凋亡——流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期腻惠、Caspase3/7活性檢測环肘、ROS（活性氧）檢測、MMP（線粒體膜電位）檢測等集灌；
細(xì)胞自噬——通過免疫組化/western-blot檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物（LC3和Beclin-1）的相對表達(dá)量悔雹。
6、相關(guān)信號通路分析——細(xì)胞凋亡和自噬過程都是伴隨著相關(guān)的信號通路（singling pathway）欣喧。
Caspase-3/Caspase-9?singling pathway：
細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是抑制細(xì)胞生長的一種方法腌零，Caspase-3/-9是細(xì)胞凋亡的兩個(gè)關(guān)鍵成員。凋亡相關(guān)因子包括Caspase-3唆阿，Caspase-9莱没，Bcl-2和Bax。Western-blot和RT-qPCR檢測對應(yīng)的蛋白或mRNA：Caspase-3酷鸦、Caspase-9、Bcl-2、Bax臼隔。
PI3K/Akt/mTOR singling pathway：
PI3K/Akt/mTOR信號通路在腫瘤中研究較多嘹裂。在轉(zhuǎn)染miRNA-142-5p后，結(jié)合相關(guān)通路抑制劑或激活劑（PI3K的抑制劑：LY294002摔握；mTOR抑制劑：雷帕霉素（RAP）寄狼；PI3K/Akt/mTOR通路的激活劑：胰島素insulin），通過western-blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)量氨淌，包括Akt泊愧、p-Akt（磷酸化）、mTOR盛正、p-mTOR删咱。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
成瘤實(shí)驗(yàn)（Tumor formation assay）——小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證】
從肺癌細(xì)胞系中找出miRNA-142-5p表達(dá)最低的那個(gè)細(xì)胞系，然后過表達(dá)miRNA-142-5p豪筝；或者找出miRNA-142-5p表達(dá)最高的那個(gè)細(xì)胞系痰滋，然后進(jìn)行RNAi技術(shù)，敲低/沉默miRNA-142-5p续崖。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過皮下注射到BALB/c裸鼠中敲街，15 d左右后，處死小鼠严望，收獲腫瘤并測量腫瘤的重量及大小多艇。
理論上講，實(shí)驗(yàn)方法越多像吻，內(nèi)容越飽滿峻黍，相對而言越容易發(fā)高分的文章，當(dāng)然萧豆，這還得考慮個(gè)人實(shí)際情況奸披，尤其是基金的預(yù)算以及您想要發(fā)幾分的文章，不可盲目涮雷。阵面。。
關(guān)于幾分的文章對應(yīng)哪些實(shí)驗(yàn)方案洪鸭，在這里小編簡單的介紹一下：
0-1分：
單個(gè)細(xì)胞系样刷，單組轉(zhuǎn)染miRNA（根據(jù)細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)情況來確定是過表達(dá)還是敲低轉(zhuǎn)染），做一些簡單的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)即可（細(xì)胞增殖览爵、遷移/侵襲置鼻、細(xì)胞凋亡--流式細(xì)胞檢測凋亡率）。
1-3分：
臨床組織樣本和多個(gè)細(xì)胞系（2-3個(gè)）蜓竹，單組轉(zhuǎn)染miRNA（根據(jù)細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)情況來確定是過表達(dá)或者敲低轉(zhuǎn)染）箕母，豐富相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)储藐，比如說細(xì)胞凋亡，除了利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率之外嘶是，還可以檢測細(xì)胞周期钙勃、Caspase3/7活性、MMP檢測聂喇、ROS檢測等辖源。
3-5分：
臨床組織樣本和多個(gè)細(xì)胞系（3-5個(gè)）；兩種miRNA轉(zhuǎn)染形式：過表達(dá)和敲低/沉默（其中siRNA可以設(shè)計(jì)2-3條對應(yīng)序列）希太；研究相關(guān)信號通路以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（小鼠成瘤）驗(yàn)證miRNA的作用克饶。
5-7分：
這算是一個(gè)高分文章了，所以思路相對要變一點(diǎn)誊辉，不能按照傳統(tǒng)模式下去矾湃。與5分以下文章相比，除了一些常規(guī)的研究之外芥映，具有一個(gè)很重要的創(chuàng)新點(diǎn)：利用生信分析——基因表達(dá)微陣列（Gene expression microarray assay）檢測腫瘤組織與鄰近正常組織差異表達(dá)的miRNA和基因洲尊，通過表達(dá)以及敲除/沉默兩種手段進(jìn)行轉(zhuǎn)染miRNA或相對應(yīng)的基因。除此之外奈偏，在細(xì)胞系以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法的選擇上也更多拷橘，以及相關(guān)的信號通路研究和小鼠成瘤驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也是必不可少的雨让。
不管您發(fā)幾分的文章混狠，有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)是必不可少的桐腌，第一個(gè)就是靶基因的預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測；第二個(gè)就是RT-qPCR和western-blot裁蚁，檢測相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)情況矢渊。
好了，今天小編就先介紹到這里了枉证，如果您有什么想法或者問題矮男，歡迎留言或者直接聯(lián)系溝通哦！Ｊ已琛毡鉴！
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