文獻

2023

Nature Genetics

Distinct chromatin signatures in the Arabidopsis male gametophyte

研究背景

1蘑志、植物和動物在繁殖方式上有根本的不同荣茫。

在動物中浪默，原始生殖細胞是在胚胎早期的原腸胚形成階段產(chǎn)生的。相比之下吨述，植物的生殖細胞是由體細胞發(fā)育而來的枪汪，此時發(fā)生了從營養(yǎng)到生殖的轉(zhuǎn)變坛增。此外兰绣，植物配子被認為具有全能性或多能性，而這些特性只屬于哺乳動物的受精卵或胚胎干細胞聋丝。

在哺乳動物中索烹，由于在配子形成和受精后的受精卵中觀察到廣泛的表觀遺傳重編程，因此認為表觀遺傳信息的代際傳遞是罕見的弱睦。在植物中百姓，參數(shù)突變和表觀等位基因等可以通過DNA甲基化的形式穩(wěn)定地傳遞給后代。

植物組蛋白標(biāo)記重編程的程度和機制的研究仍然很少况木。

2垒拢、一些證據(jù)表明旬迹，在植物的生殖細胞中可能已經(jīng)清除了組蛋白修飾。例如求类，擬南芥的開花抑制基因FLC在寒冷冬季通過建立局部的H3K27me3區(qū)域被沉默奔垦，這種表觀記憶在下一代中被重置以保持春化需求。有趣的是尸疆，在春化后觀察到FLC在受精后重新激活椿猎，同時在成熟花粉中保持沉默。FLC上的重置機制相當(dāng)復(fù)雜寿弱，涉及到H3K27me3去甲基化酶和轉(zhuǎn)錄激活因子犯眠，并且重置的時機可能在父源等位基因和母源等位基因之間有所不同。

3症革、在哺乳動物的生殖細胞中觀察到DNA甲基化的全局耗竭筐咧。在精子成熟后，組蛋白逐漸被精蛋白替代噪矛，形成一個緊湊的精子染色質(zhì)量蕊，不參與轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制。值得注意的是艇挨，精蛋白向組蛋白的替換是不完全的危融，一些核小體保留下來，包括在胚胎干細胞中存在的許多雙價啟動子雷袋。

目前的證據(jù)表明，擬南芥雄性生殖細胞中的表觀重編程與此有所不同辞居。首先楷怒，無論是精子還是植物雄配子體的營養(yǎng)細胞，DNA甲基化并未在全局范圍內(nèi)耗竭瓦灶。其次鸠删，擬南芥中不存在精蛋白，而組蛋白變體H3.10在擬南芥精子細胞中高度表達贼陶，并可能取代H3.1和H3.3刃泡。有人提出，通過H3.10對經(jīng)典H3的替換碉怔、活性組蛋白去甲基化以及H3K27me3寫入因子的低表達烘贴，擬南芥精子細胞中的H3K27me3標(biāo)記全局喪失。然而撮胧，由于缺乏相應(yīng)突變體中H3K27me3染色質(zhì)免疫沉淀測序數(shù)據(jù)集桨踪，這些事件對H3K27me3重編程的貢獻尚不清楚。有趣的是芹啥，H3.10的基因敲除并不影響生育能力锻离。第三铺峭，鑒于通過RNA測序檢測到大量轉(zhuǎn)錄本，擬南芥精子細胞可能具有轉(zhuǎn)錄活性汽纠。

本文亮點

在本研究中卫键，我們解決了在雄配子體中排序細胞類型的ChIP-seq技術(shù)限制，并提供了小孢子（Ms）虱朵、精子（Spm）和營養(yǎng)細胞（Veg）的表觀基因組景觀的綜合概述莉炉。我們的工作揭示了H3K27me3和H3K4me3在雄性生殖細胞系中的重編程動態(tài)和特征，并為代際間的表觀遺傳和重構(gòu)提供了啟示卧秘。

結(jié)論01?精子和營養(yǎng)核中明顯的組蛋白修飾特征

Fig1a

通過細胞類型的分選呢袱，得到了雄配子體中的營養(yǎng)細胞核、精子細胞核以及小孢子翅敌，由于細胞起始量過于低羞福，作者開發(fā)了一種超靈敏的ChIP-seq來獲取三者以及幼苗的組蛋白修飾（Fig1a）。

Fig 1c

在四類細胞 （Ms-小孢子蚯涮， Veg-營養(yǎng)細胞核治专， Sdl-幼苗， Spm-精子細胞核）中鑒定H3K27me3和H3K4me3的峰（Fig1c）遭顶，在精子細胞核和營養(yǎng)細胞核中發(fā)現(xiàn)了大量特定于每種細胞類型的H3K27me3峰值张峰，這表明在雄配子體發(fā)育過程中存在普遍且特定于細胞類型的H3K27me3重編程。

Fig S3a

與幼苗和營養(yǎng)細胞核相比棒旗，精子細胞核Spm中的H3K27me3在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）周圍富集更多喘批，而H3K4me3的整體分布模式在所有四種細胞類型中相似（Fig S3a）。

Fig 1d, e

FigS8

被H3K4me3標(biāo)記的基因與所有四種細胞類型中的mRNA表達相關(guān)（Fig1d铣揉，F(xiàn)igS8）饶深。

精子細胞核Spm中的H3K27me3標(biāo)記基因也與mRNA表達相關(guān)（Fig1e，F(xiàn)igS8）逛拱。

因此敌厘，精子細胞核和營養(yǎng)細胞核具有不同的染色質(zhì)特征，表明在雄配子體發(fā)育過程中存在復(fù)雜的組蛋白修飾重編程朽合。

01 生信分析

ChIP-seq call peak

metaplot

peak與基因關(guān)聯(lián)

基因表達量的箱線圖

結(jié)論02 精子染色質(zhì)具有廣泛的二價性

Fig 2a

Fig 2d,e

HBGs標(biāo)記基因的表達量更高（Fig2d, e）

Fig 2f

對于這些二價標(biāo)記的基因俱两，散點圖展示了H3K247me3 和H3K4me3有明顯的正相關(guān)，箱線圖把這些區(qū)域根據(jù)兩種組蛋白修飾的密度從高到低分成四份曹步，也發(fā)現(xiàn)了組蛋白修飾與基因表達正相關(guān)（Fig 2f）宪彩。

02 生信分析

兩組區(qū)間的韋恩圖以及顯著性檢驗

相關(guān)性分析

結(jié)論03 CBG和HBG通過不同方式建立

Fig 3a, c

對精子細胞核Spm的HBGs進一步研究發(fā)現(xiàn)，HBGs鄰近的H3K27me3和H3K4me3都類似于體細胞中的典型H3K4me3模式讲婚，在TSS周圍富集(Fig 3a)毯焕。

并且，HBGs在幼苗和小孢子中基本不含H3K27me3，而在小孢子中主要被H3K4me3標(biāo)記纳猫，所以作者推斷婆咸，HBGs周圍的二價區(qū)域主要是在小孢子形成之后通過TSS周圍H3K27me3的獲得而建立的。

與HGBs相反芜辕，CBGs通常以H3K27me3和H3K4me3擴散到基因體區(qū)域為特征尚骄，再現(xiàn)了體細胞中典型的H3K27me3模式(Fig 3c)。

大多數(shù)CBGs在幼苗和小孢子中都有H3K27me3標(biāo)記侵续，并且H3K27me3從幼苗到小孢子有輕微的減少趨勢(圖3c)倔丈。相反，H3K4me3從幼苗積累到小孢子状蜗，并進一步積累到精子需五。因此，典型H3K27me3的存在可能是CBGs周圍二價區(qū)域形成的先決條件轧坎。

03 生信分析

特定基因附近的組蛋白信號metaplot

結(jié)論04 CBG和HBG有不同的功能

Fig 3e, f

對HBG和CBG進行功能富集發(fā)現(xiàn)宏邮，HBG顯著富集到與精子發(fā)生密切相關(guān)的功能（Fig 3e），比如與DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因被顯著富集缸血。

對于CBGs來說蜜氨，參與代謝過程的基因，比如參與果膠和其他多糖代謝的基因被顯著富集(Fig 3f)捎泻，而它們在小孢子和精子中都是沉默的飒炎。有趣的是，這些基因在精子中并不是必需的笆豁，但在受精后胚胎細胞分裂過程中郎汪，它們對細胞壁的形成很重要，因此CBGs也可能處于靜止?fàn)顟B(tài)闯狱，等待受精后的激活或抑制煞赢。

04 生信分析

GO功能富集

結(jié)論05 H3K27me3的重置發(fā)生在整個配子發(fā)生過程中

Fig 4a

Fig 4b

為了探究組蛋白修飾在配子發(fā)生的過程中是否發(fā)生全面清除，作者觀察了幼苗（體細胞）中被H3K27me3標(biāo)記的所有基因扩氢，并根據(jù)它們在精子中的狀態(tài)分成5份（Fig4a）。

整體而言爷辱，從體細胞到精子录豺，H3K27me3發(fā)生了整體上的下降。HBG是例外饭弓，因為它們通常在整個種系發(fā)育過程中獲得H3K27me3双饥。然而，在精子中還是有許多體細胞H3K27me3的peak區(qū)域仍然在被H3K27me3標(biāo)記弟断，特別是在CBGs和與H3K27me3單價結(jié)構(gòu)區(qū)相關(guān)的基因上咏花。

作者進一步量化了H3K27me3從幼苗到精子的減少，重點關(guān)注了5804個在幼苗中顯示H3K27me3 ChIP-seq信號 RPKM>20 的基因，以獲得高信度昏翰。其中苍匆，3346個基因減少2倍以上，714個基因減少4倍以上(Fig 4b)棚菊，這714個基因被定義為“重置基因”浸踩，因為它們周圍的H3K27me3被相對完整地去除。

Fig 4c

Fig 4d

進一步分析發(fā)現(xiàn)统求，在基因上H3K27me3的重置在小孢子中已經(jīng)開始(Fig 4c, d)检碗，這表明重置是一個漸進的過程，通常在小孢子形成之前就開始了码邻。

metaplot分簇-帶散點的箱線圖

05 生信分析

metaplot分簇

帶散點的箱線圖

結(jié)論06?H3K27me3在發(fā)育調(diào)控中重置

Fig 4e

Fig 4f

體細胞H3K27me3在部分基因上的缺失的意義是什么折剃？作者進一步探究。在H3K27me3重置基因中像屋，花輪發(fā)育基因顯著富集(Fig 4e)怕犁，包括AG、PI和SEP1开睡、SEP3(Fig 4e-g)因苹。

Fig 4g

體細胞H3K27me3在部分基因上的缺失的意義是什么？作者進一步探究篇恒。在H3K27me3重置基因中扶檐，花輪發(fā)育基因顯著富集(Fig 4e)，包括AG胁艰、PI和SEP1款筑、SEP3(Fig 4e-g)。

有趣的是腾么，這些基因在花分生組織中特異性表達奈梳，以促進雄蕊的形成(Fig 4f,g)，雄蕊是產(chǎn)生雄性配子體的器官解虱，這表明它們的H3K27me3水平在種系指定之前被重置攘须。

這些基因表明，在小孢子形成之前殴泰，重置可能發(fā)生在多個時間點于宙。

Fig 4h

相反，與胚胎模式形成相關(guān)的基因悍汛，如FUS3捞魁、WOX11和XND1，在小孢子中僅顯示H3K27me3的輕度減少(Fig 4h)离咐，這表明它們的重置主要發(fā)生在小孢子形成后谱俭。

Fig 4i

有趣的是，盡管重置基因的mRNA水平在精子中通常無法檢測到，但它們通常在精子形成之前或受精后表達（Fig 4i）昆著。因此县貌，在雄性生殖系中存在一種機制，以使重置基因處于沉默狀態(tài)宣吱。

上述情況對于FLC也是適用的窃这，F(xiàn)LC是表觀遺傳重置的典型例子。在小孢子中已經(jīng)開始對FLC進行重置（Fig 4h）征候，并在早期胚胎中保持沉默狀態(tài)杭攻，直到下一代出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子LEC1。因此疤坝，在受精后可能會發(fā)生表觀基因組的進一步重編程兆解，并且精子中缺乏H3K27me3可能會降低胚胎中一部分基因（如FLC）的激活阻礙。

06 生信分析

測序數(shù)據(jù)的局部展示

熱圖

結(jié)論07 H3.10的摻入增強了精子染色質(zhì)特性

Fig 5b-d

有觀點認為跑揉，精子中存在一種特異的組蛋白變體H3.10锅睛，它可能通過滲入和替換傳統(tǒng)的組蛋白H3.1，導(dǎo)致精子中的H3K27me3發(fā)生重置历谍。通過研究H3.10基因敲除突變體（htr10）中精子的染色質(zhì)修飾现拒，我們觀察到WT和htr10共有7,718個H3K27me3峰發(fā)生重疊，占野生型的Spm H3K27me3峰的74%（Fig 5b）望侈。值得注意的是印蔬，有4,230個htr10特異的H3K27me3峰（Fig 5b，group1）脱衙，表明H3.10有助于對抗精子中的H3K27me3侥猬。有趣的是，與WT和htr10共享的峰相比捐韩，htr10特異的峰在幼苗中通常顯示出更低水平的H3K27me3（Fig 5b退唠，c），這表明H3.10更常在非典型的H3K27me3區(qū)域中對抗H3K27me3荤胁。事實上瞧预，在典型的H3K27me3區(qū)域中，htr10中的H3K27me3僅略微增加（Fig 5d）仅政。

Fig 5f

Fig 5g

4,230個htr10特異的H3K27me3峰在營養(yǎng)細胞核中被H3K27me3標(biāo)記垢油，這表明H3.10在精子中的摻入主要用于對抗那些在營養(yǎng)細胞核階段進一步建立的H3K27me3區(qū)域（Fig5b, c, f）。另外已旧，一些H3K27me3峰在htr10中消失秸苗，表明H3.10可能在塑造HBGs的H3K27me3中也發(fā)揮作用（Fig 5b, c, g）召娜。

07 生信分析

韋恩圖

metaplot分簇

測序數(shù)據(jù)的局部展示

箱線圖

熱圖

結(jié)論08 許多H3K27me3單價區(qū)域在營養(yǎng)細胞中建立

Fig 6a, b

與動物不同运褪，開花植物產(chǎn)生不活動的精子細胞，這些細胞通過由營養(yǎng)細胞發(fā)育而來的花粉管傳遞。

因此秸讹，我們研究了營養(yǎng)細胞染色質(zhì)在受精過程中如何配置以適應(yīng)其功能檀咙。根據(jù)組蛋白修飾把營養(yǎng)細胞染色質(zhì)可分為三類，發(fā)現(xiàn)H3K27me3單價峰與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)璃诀，而二價峰和H3K4me3單價峰與基因表達相關(guān)（Fig6a）弧可。與精子Spm相比，營養(yǎng)細胞Veg染色質(zhì)有大量的H3K27me3單價峰劣欢，其中包括許多Veg特異性峰（Fig 6b）棕诵。

Fig 6c

Fig 6d, e

將與H3K27me3單價峰相關(guān)的基因根據(jù)它們在幼苗中的H3K27me3水平分為四個四分位數(shù)，并觀察相應(yīng)的營養(yǎng)細胞凿将、小孢子和幼苗中的H3K27me3和H3K4me3模式（Fig 6c）校套。

發(fā)現(xiàn)第一和第二四分位數(shù)通常在幼苗和小孢子中含有H3K27me3（Fig 6c），發(fā)育調(diào)節(jié)因子和次生代謝基因等典型PRC2靶點富集在第一四分位數(shù)中（Fig 6d）牧抵。

相反笛匙，第三和第四四分位數(shù)中的基因通常在幼苗和小孢子中不含H3K27me3（Fig 6c），而在后者中標(biāo)記有H3K4me3犀变，表明這些H3K27me3區(qū)域是在營養(yǎng)細胞中新建立的（Fig 6c）妹孙。與細胞周期和減數(shù)分裂相關(guān)的基因富集在第四四分位數(shù)中（Fig 6e）；這些基因在減數(shù)分裂和花粉有絲分裂I中起重要作用获枝，但在進入G0期和停止分裂的營養(yǎng)細胞中不起作用蠢正。

08 生信分析

箱線圖

多組區(qū)間韋恩圖

metaplot分簇

GO功能富集

結(jié)論09 授粉相關(guān)基因被基因體H3K4me3標(biāo)記

Fig 6f

對授粉和花粉管生長重要的基因（如BUPS150，ANX1和ANX2）在營養(yǎng)細胞中是高度表達的映琳。有趣的是机隙，在營養(yǎng)細胞中，這些基因主要由H3K4me3標(biāo)記 （Fig 6f）萨西。

Fig g-i

進一步作者開始研究H3K4me3與基因相對分布模式是否對營養(yǎng)細胞中基因表達存在影響有鹿。

作者根據(jù)H3K4me3在基因上的分布模式對基因進行聚類，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)細胞中的一部分基因（1,338個基因谎脯；Fig 6g）的H3K4me3結(jié)域覆蓋了整個基因區(qū)域葱跋，但在幼苗（體細胞）中卻沒有（Fig 6h）。這些基因的表達水平高于那些在TSS周圍有H3K4me3峰值的基因源梭，并且富集到與花粉管和授粉相關(guān)基因（Fig 6i）娱俺。因此，營養(yǎng)細胞中g(shù)ene body區(qū)域的的H3K4me3對基因表達是至關(guān)重要的废麻。

09 生信分析

測序數(shù)據(jù)的局部展示

熱圖

箱線圖

結(jié)論10 營養(yǎng)細胞染色質(zhì)的獨特特征?

Fig7a, b

Fig 7c-e

由于精子Spm和營養(yǎng)細胞Veg在視覺上有明顯差異荠卷，所以推測它們在染色質(zhì)可及性等方面存在差異。

作者在精子和營養(yǎng)細胞核中生成了ATAC-seq數(shù)據(jù)和H3K9me2的ChIP-seq數(shù)據(jù)烛愧，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)細胞染色質(zhì)在基因體油宜、基因間區(qū)域和著絲點周圍區(qū)域通常比精子和幼苗更容易接觸（Fig 7a-d）

此外掂碱，營養(yǎng)細胞中著絲點周圍區(qū)域的染色質(zhì)可及性增加并伴隨了H3K9me2的增加（Fig 7e）

10 生信分析

測序數(shù)據(jù)的局部展示

metaplot

餅圖

全基因組密度圖

結(jié)論11?特定染色質(zhì)的domain具有明顯的可及性

Fig 7f

Fig h, i

最后，我們研究了染色質(zhì)可及性與組蛋白修飾之間的關(guān)系慎冤。我們發(fā)現(xiàn)疼燥，HBGs的啟動子在所有Spm染色質(zhì)區(qū)域中顯示出最高水平的染色質(zhì)可及性（Fig 7f, h），這表明HBGs可能具有更高的表達潛力或已經(jīng)被活躍的表達蚁堤。相比之下醉者，CBGs的啟動子、H3K27me3單價基因和重置基因的染色質(zhì)可及性要低得多（圖7f, i）披诗。有趣的是撬即，CBGs的染色質(zhì)可及性明顯高于H3K27me3單價基因（Fig 7f），盡管兩組基因均未表達呈队。

Fig 7g

Fig 7k

在營養(yǎng)細胞中搞莺，不同的染色質(zhì)區(qū)域通常比精子中的相應(yīng)類型更加開放，除了雙價染色質(zhì)區(qū)域（例如掂咒，精子中的HBGs）（Fig 7g）才沧。此外，基因體H3K4me3區(qū)域在不同染色質(zhì)區(qū)域中顯示出最高水平的染色質(zhì)可及性（Fig 7g,k）绍刮。綜上所述温圆，不同的染色質(zhì)區(qū)域在染色質(zhì)可及性方面具有明顯差異，這不僅僅是表達水平的簡單反映孩革，而可能是它們轉(zhuǎn)錄潛力的指示器岁歉。

11 生信分析

箱線圖

測序數(shù)據(jù)的局部展示

總結(jié)

這項研究創(chuàng)立了一種超高靈敏度的染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）方法，適用于植物雄配子體細胞膝蜈。該方法與染色質(zhì)開放性測序（ATAC-seq）和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）等多組學(xué)技術(shù)相結(jié)合锅移，首次揭示了模式開花植物擬南芥在雄性生殖細胞系的發(fā)育和成熟過程中，組蛋白修飾H3K27me3和H3K4me3的重編程特征和機制饱搏。這項研究為我們理解植物表觀遺傳信息在代際間的遺傳和重置過程提供了重要參考非剃。

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