以Entranster-E 電轉(zhuǎn)染試劑為例
八劳跃、電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，如何設(shè)置正確的siRNA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組蛔糯？
1.設(shè)置空白對(duì)照組启搂，檢驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。
2.設(shè)置陰性對(duì)照組拳魁，無(wú)血清培養(yǎng)基 + Entranster-E 電轉(zhuǎn)染試劑 + 陰性siRNA惶桐。
3.設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，無(wú)血清培養(yǎng)基 + Entranster-E 電轉(zhuǎn)染試劑+ 靶向siRNA 轉(zhuǎn)染管家基因潘懊，比如GAPDH 或者 Lamin A/C姚糊，之后通過(guò)western blotting 或者 mRNA quantification檢測(cè)基因的表達(dá)。
九授舟、電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)救恨，DNA有什么要求？
使用高純度释树、無(wú)菌和無(wú)污染的DNA進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)肠槽。質(zhì)粒DNA要求無(wú)內(nèi)毒素，OD值為1.8-2.0奢啥。不建議使用微型核酸制備試劑盒準(zhǔn)備DNA秸仙，因?yàn)樗赡芎懈咚降膬?nèi)毒素。
不要使用僅用乙醇沉淀法純化的DNA桩盲。乙醇沉淀法中殘留的鹽會(huì)引起電流改變并對(duì)電穿孔產(chǎn)生負(fù)面影響寂纪。 建議DNA的濃度范圍為1-5
mg/ml。使用濃度較高的DNA可能會(huì)導(dǎo)致與細(xì)胞不均勻混合。而核酸濃度較低則可能稀釋電穿孔混合物捞蛋。
十孝冒、電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，siRNA有什么要求拟杉？
使用高純度庄涡、無(wú)菌的siRNA。確定電轉(zhuǎn)染的最佳siRNA濃度搬设。建議在250-750nM最終濃度范圍內(nèi)的進(jìn)行siRNA不同濃度的梯度實(shí)驗(yàn)穴店。建議設(shè)置一個(gè)非靶向或無(wú)意義的siRNA對(duì)照序列，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)siRNA的特異性焕梅。同時(shí)也驗(yàn)證迹鹅，針對(duì)單個(gè)基因用多個(gè)siRNA序列實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的表型是否是由于脫靶效應(yīng)所致。
十一贞言、如何提高電轉(zhuǎn)染效率斜棚？
1.? 選擇合適的電場(chǎng)強(qiáng)度
合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要，電場(chǎng)強(qiáng)度不能過(guò)高该窗，過(guò)高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率弟蚀；也不能過(guò)低，過(guò)低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔酗失。不同細(xì)胞系具有不同的最佳場(chǎng)強(qiáng)值义钉，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度。
2.? 選擇合適的細(xì)胞
用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（15代以內(nèi)规肴，傳代后2d）捶闸。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差拖刃，電轉(zhuǎn)后删壮，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA.
3.? 質(zhì)粒質(zhì)量要好
應(yīng)選擇純度高的質(zhì)粒兑牡，首先DNA／RNA應(yīng)該超純(A260／A280>1．8)央碟，其次應(yīng)不含內(nèi)毒 素，同時(shí)質(zhì)粒應(yīng)溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液均函。另外亿虽，DNA濃度不宜過(guò)高。
4.? 選擇合適的電轉(zhuǎn)染試劑
電擊會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的傷害苞也，在轉(zhuǎn)染試劑的選擇上要注意洛勉，應(yīng)選擇具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster-E如迟，可將電擊對(duì)細(xì)胞的損傷降到最低收毫。并且，Entranster-E可適用于lonza、Bio-rad牛哺、BTX等多種電轉(zhuǎn)儀
