CRISPR簡述

歷史發(fā)展

目前已有的基因編輯技術(shù)

（1）鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease赊锚，ZFN)：是第一代人工核酸內(nèi)切酶

鋅指是一類能夠結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)孩擂，人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子中大約有一半含有鋅指結(jié)構(gòu)驹暑，ZFN 是將鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶 Fok I融合形成的核酸內(nèi)切酶谚鄙，利用它可以在各種復(fù)雜基因組的特定位置制造 DNA 的雙鏈切口（這就是英文文獻(xiàn)中說到的DSB撵溃，當(dāng)時(shí)只當(dāng)是DNA雙鏈斷裂葬项，卻不知其實(shí)叫做雙鏈切口）。

（2）類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease洪鸭，TALEN)：第二代人工核酸酶。

（3）Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 第三代人工核酸內(nèi)切酶（前兩代就是ZFN和TAILEN）仑扑。
（4）人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease览爵，EEN)

科學(xué)發(fā)現(xiàn)

1. CRISPR一詞正式登上歷史舞臺(tái)還是2002年的事。Jansen****實(shí)驗(yàn)室****通過生物信息學(xué)分析镇饮，發(fā)現(xiàn)這種新型DNA序列家族只存在于細(xì)菌及古生菌中蜓竹，而在真核生物及病毒中沒有被發(fā)現(xiàn)，并將這種序列稱為規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)储藐。他們將臨近CRISPR locus的基因命名為cas（CRISPR-associated）俱济，并發(fā)現(xiàn)了4個(gè)cas基因（cas1, cas2, cas3, cas4。

2. CRISPR能在細(xì)菌的免疫功能中起作用由Horvath****研究組在2007首次得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)钙勃。

3. 2008年蛛碌，Oost****實(shí)驗(yàn)室揭示了宿主細(xì)胞中CRISPR的間隔序列如何在cas蛋白的協(xié)助下介導(dǎo)發(fā)揮抗病毒作用。

4. 2011年肺缕，Charpentier****研究組通過對人類病原體化膿性鏈球菌的差異化RNA測序左医，揭示了反式編碼crRNA（tracrRNA）參與pre-crRNA的加工成熟過程。她們的研究證明同木，在雙鏈RNA指導(dǎo)下切割雙鏈DNA斷裂的內(nèi)切酶家族并揭示了CRISPR/Cas系統(tǒng)在RNA指導(dǎo)下進(jìn)行基因編輯的巨大潛力浮梢。

5. 2012年6月，Doudna****/Charpentier聯(lián)合課題組在《科學(xué)》雜志上發(fā)表CRISPR/Cas9作為基因編輯技術(shù)的第一篇研究論文彤路，首次在體外證明CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割任何的DNA鏈秕硝，指出CRISPR在活細(xì)胞中修改基因的能力，并且完整的討論了CRISPR在基因組編輯上的可行性

6. 2013年1月洲尊，哈佛大學(xué)的George Church實(shí)驗(yàn)室和麻省理工學(xué)院/哈佛大學(xué)的Broad****研究所的張鋒課題組在同一期的《科學(xué)》雜志上發(fā)表文章远豺，證實(shí)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被成功地運(yùn)用到人類細(xì)胞的基因組，實(shí)現(xiàn)了CRISPR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯

Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)研究坞嘀，而張峰和George Church在各種人類細(xì)胞中的應(yīng)用方面貢獻(xiàn)較多躯护，其中張鋒對CRISPR/Cas9技術(shù)方面的改進(jìn)也有突出的貢獻(xiàn)。

系統(tǒng)介紹

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）：是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的有規(guī)律成簇又帶間隔的短回文序列丽涩，可以幫助細(xì)菌抵抗噬菌體的入侵棺滞，是細(xì)菌針對噬菌體的獲得性免疫。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)矢渊。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后继准，能夠把病毒基因的一小段存儲(chǔ)到自身的 DNA 里一個(gè)稱為 CRISPR 的存儲(chǔ)空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時(shí)矮男，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識(shí)別病毒移必，將病毒的DNA切斷而使之失效。

CRISPR locus是由幾個(gè)原件構(gòu)成毡鉴，如下圖：一開始是個(gè)反向轉(zhuǎn)錄的RNA崔泵，是特異的非編碼RNA秒赤，可以和重復(fù)序列部分互補(bǔ)（trancrRNA，橙色矩形）憎瘸，后面是各種cas基因（箭頭表示）倒脓，接著是CRISPR排列（棕色的菱形是重復(fù)序列，彩色的是間隔）含思。而這些間隔序列是細(xì)菌從噬菌體DNA中獲得的遺傳序列：當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌，細(xì)菌激活相關(guān)的cas基因——Cas1甘晤，Cas2,和Csn2含潘，將其中新的間隔序列整合到自身的CRISPR arry中。一旦獲得新的間隔序列以后线婚，新的spacer就會(huì)出現(xiàn)在pre-crRNA中遏弱，此時(shí)tracrRNA與不同的SPACER互補(bǔ)，在RNaseIII的作用下塞弊，產(chǎn)生crRNA漱逸，進(jìn)一步在其他未知的核酸酶的作用，剪切crRNA的5'端游沿，使得引導(dǎo)序列長為20nt饰抒。如果噬菌體注入DNA，那么這個(gè)免疫系統(tǒng)將被激活诀黍，來干擾剪切噬菌體DNA袋坑，起到獲得性免疫作用。

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經(jīng)過廣譜檢測眯勾，人們發(fā)現(xiàn)了三種主要的CRISPR系統(tǒng)枣宫，它們由CRISPR-associated (Cas)基因、非編碼rna和一組獨(dú)特的重復(fù)元素(直接重復(fù))組成吃环，而這些重復(fù)序列則由來自外源性DNA靶點(diǎn)(即原間隔體)的短可變序列直接間隔開來也颤；重復(fù)序列+間隔序列=CRISPR RNA (crRNA) array。在有DNA靶點(diǎn)的情況下郁轻，每一個(gè)間隔序列都有一個(gè)前間區(qū)序列鄰近基序（PAM——Ⅱ型系統(tǒng)的PAM基序?yàn)?code>5-NGG-3）翅娶。

II型CRISPR系統(tǒng)是最具特征的系統(tǒng)之一，它由核酸酶Cas9范咨、編碼引導(dǎo)rna的crRNA陣列和有助于將crRNA陣列加工成離散單元的所需輔助反式激活crRNA (tracrRNA)組成

S. pyogenes亞型II-A Cas9(1368個(gè)氨基酸)是基因組工程中研究最多故觅、使用最多的Cas9版本。其優(yōu)勢是：氨基酸序列相對較小渠啊，方便操作输吏，且只是需要一個(gè)DNA內(nèi)切酶Cas9來對與sgRNA20個(gè)互補(bǔ)堿基的帶有PAM結(jié)構(gòu)的DNA進(jìn)行剪切。剪切后是DNA產(chǎn)生平末端的DSB（雙鏈斷裂）替蛉，然后在進(jìn)行非同源的末端連接(NHEJ)過程中贯溅，容易隨機(jī)插入或者刪除或者替換拄氯。或者進(jìn)行高保真的同源定向修復(fù)(HDR)它浅，修復(fù)DNA译柏。

CRISPR RNA (crRNA) array，編碼gRNA姐霍，再加上tracrRNA鄙麦，則可達(dá)到定位+編輯的功能，gRNA用于引導(dǎo)镊折，tracrRNA用于結(jié)合靶點(diǎn)胯府。把crRNA和tracrRNA合在一起，成為了single-guide RNA恨胚，即sgRNA骂因，而通過修改tracrRNA的序列，在理論上可以on-target任何目的靶點(diǎn)赃泡。

這項(xiàng)技術(shù)主要由sgRNA定位到一個(gè)基因位點(diǎn)上寒波，由Cas9酶在該位點(diǎn)進(jìn)行DNA雙鏈的切割，切割導(dǎo)致DNA修復(fù)通路的激活升熊，使得其它的堿基加入進(jìn)切割的位點(diǎn)俄烁，造成frameshift突變，使得基因無法被表達(dá)成功能性蛋白级野。

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DOI:10.1146/annurev-biophys-062215-010822

1. 首先猴娩，sgRNA和Cas9相結(jié)合。Cas9發(fā)生了形狀上的變化勺阐，形成激活狀態(tài)卷中。

• ==PAM是target DNA上的一小段序列==，不同的Cas9識(shí)別不同PAM渊抽。

• 拿Streptococcus pyogenesis中的Cas9來說蟆豫，它識(shí)別的PAM是5′-NGG-3′c因此在設(shè)計(jì)sgRNA的時(shí)候，需要先找到GG懒闷，然后取其旁邊的序列十减。

• 大部分基因序列都有GG。但如果沒有GG愤估，就用其它細(xì)菌提出來的Cas9來做帮辟。

2. Cas9會(huì)在PAM上游第三個(gè)堿基后切斷雙鏈，由Cas9的HNH和RuvC部分來進(jìn)行剪切玩焰。

3. 雙鏈斷裂（DSB）之后由驹，會(huì)有兩種修復(fù)方式發(fā)生的可能：

• Non-Homologous End Joining (NHEJ)

• Homology Directed Repair (HDR)

Cas9造成基因不被表達(dá)是由NHEJ修復(fù)通路引起，然而昔园，Cas9造成的DSB并不一定會(huì)引發(fā)NHEJ蔓榄，因?yàn)镈SB end的堿基并沒有任何損壞并炮，這種end也叫blunt end，很容易再次粘連在一起甥郑，此時(shí)可以通過外源性同源重組引入Gene drive逃魄，或者說blunt end再次粘連在一起，sgRNA也會(huì)會(huì)再次識(shí)別這段序列澜搅，然后Cas9會(huì)再次切伍俘，反復(fù)下去，直到發(fā)生了由NHEJ引導(dǎo)出的突變勉躺，sgRNA才不會(huì)識(shí)別這段序列养篓。

生物學(xué)

CRISPR

CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成赂蕴。

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①前導(dǎo)序列：富含AT堿基，位于CRISPR基因上游舶胀，被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子概说。

②重復(fù)序列：長度約20–50 bp堿基且包含5–7 bp回文序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)嚣伐，穩(wěn)定RNA的整體二級結(jié)構(gòu)糖赔。

③間隔序列：是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”轩端，當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí)放典，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會(huì)予以精確打擊。

CAS9

化膿性鏈球菌Cas9（以下稱為SpyCas9）是大型（1,368個(gè)氨基酸）多結(jié)構(gòu)域和多功能DNA核酸內(nèi)切酶基茵。它通過其兩個(gè)不同的核酸酶結(jié)構(gòu)域在PAM上游剪接dsDNA 3 bp：一個(gè)HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域奋构，其切割與指導(dǎo)RNA序列互補(bǔ)的DNA鏈（靶鏈），以及一個(gè)RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域拱层，其負(fù)責(zé)切割DNA弥臼。與互補(bǔ)鏈相反的鏈（非目標(biāo)鏈）。除了在CRISPR干擾中起關(guān)鍵作用外根灯，Cas9還參與crRNA成熟和間隔區(qū)獲取径缅。

CRISPR-CAS9介導(dǎo)的DNA靶向和切割模型

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CRISPR編輯技術(shù)

CRISPR DOUBLE NICKASE

先簡單介紹一下張鋒實(shí)驗(yàn)室的CRISPR DOUBLE NICKASE

和普通Cas9不同的是，Cas9n (Cas9 Nickase)上有一個(gè)D10A的氨基酸突變烙肺，這個(gè)突變使得Cas9不再導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和NHEJ修復(fù)（一種會(huì)引來突變的修復(fù)）纳猪，而是會(huì)引起單鏈斷裂和BER修復(fù)（一種不會(huì)引起突變的修復(fù)），如下圖

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利用Cas9 nickase只能進(jìn)行單鏈剪切的特性桃笙，張峰團(tuán)隊(duì)想到把兩個(gè)Cas9 nickase共同作用在一個(gè)基因位點(diǎn)上氏堤，使其形成雙鏈斷裂（DSB），而非特異性結(jié)合則不會(huì)引起DSB搏明，這樣就降低了非特異性突變丽猬。

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基因敲除（Knock-out）

Cas9可以對靶基因組進(jìn)行剪切宿饱，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下脚祟，細(xì)胞會(huì)采用高效的非同源末端連接方式（NHEJ）對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)谬以。但是，在修復(fù)過程中通常會(huì)發(fā)生堿基插入或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象由桌，造成移碼突變为黎，（移碼突變：是指DNA分子由于某位點(diǎn)堿基的缺失或插入，引起閱讀框架變化行您，造成下游的一系列密碼改變铭乾，使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。）使靶標(biāo)基因失去功能娃循，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除炕檩。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性，可將Cas9的一個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變捌斧，形成只能對DNA單鏈進(jìn)行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶笛质。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計(jì)兩條sgRNA序列，分別靶向DNA互補(bǔ)的兩條鏈捞蚂，這樣兩條sgRNA特異性的結(jié)合靶標(biāo)序列妇押，即可形成DNA斷裂，并在修復(fù)過程中通過移碼突變實(shí)現(xiàn)基因敲除

基因敲入（Knock-in）

當(dāng)DNA雙鏈斷裂后姓迅，如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)入到細(xì)胞中敲霍，基因組斷裂部分會(huì)依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因敲入丁存。修復(fù)模板由需要導(dǎo)入的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成肩杈，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈解寝，也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒锋恬。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低，通常小于10%编丘。為了增加基因敲入的成功率与学，目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率，將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時(shí)期嘉抓，促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行索守；或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ，提高HDR的效率

基因抑制抑片、基因激活（Repression or Activation）

Cas9的特點(diǎn)是能夠自主結(jié)合和切割目的基因卵佛，通過點(diǎn)突變的方式使Cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能截汪。因此疾牲，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開始衙解，從而抑制基因表達(dá)阳柔；將dCas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活蚓峦。因此dCas9與Cas9舌剂、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的暑椰，并不會(huì)對基因組DNA造成永久性的改變霍转。

多重編輯（Multiplex Editing）

將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行編輯一汽，具有基因組功能篩選作用避消。多重編輯的應(yīng)用包括：使用雙Cas9nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率、大范圍的基因組缺失及同時(shí)編輯不同的基因召夹。通常情況下岩喷，一個(gè)質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個(gè)不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯。

功能基因組篩選

利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞戳鹅，因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的』枵祝基因組篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù)枫虏，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應(yīng)以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果。CRISRP-Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢爬虱，在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用隶债。目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因跑筝、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等死讹。

Reference

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