1 摘要

人類泛基因組參考聯(lián)盟（HPRC）發(fā)布了第一版人類泛基因組草圖疹瘦。這個泛基因組包含了47個不同祖先個體的分相二倍體組裝（phased diploid assemblies）,覆蓋了每個基因組中超過99%的預(yù)期序列，在基因結(jié)構(gòu)和堿基水平的準(zhǔn)確度超過99%巡球。通過比對至新的組裝基因組言沐，人類泛基因組草圖獲得了已知的變異和單倍型信息，并在復(fù)雜結(jié)構(gòu)位點揭示了新的等位基因酣栈。相對于現(xiàn)有的參考基因組GRCh38险胰，新草圖增加了1.19億個堿基對的常染色質(zhì)多態(tài)性序列和1115個基因重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)約9000萬個新增加堿基對來自于結(jié)構(gòu)變異矿筝。與基于GRCh38的工作流程相比起便，使用該泛基因組草圖來分析短讀長測序數(shù)據(jù)可以減少34%的微小變異發(fā)現(xiàn)錯誤，每個單倍型檢測到的結(jié)構(gòu)變異數(shù)量增加104%窖维，使得每個樣本中絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)變異等位基因的分型成為可能榆综。

2 引言

自人類參考基因組草圖發(fā)布20多年以來，已經(jīng)成為人參考基因組學(xué)的支柱陈辱。初始的序列是單個人單倍體的嵌合代表奖年，每條染色體都含有一個代表性的 scaffolds 序列。目前發(fā)布的GRCh38 含有210 Mb 的gap沛贪，包括 151Mb 的未知序列和 59 Mb 的計算模擬序列陋守，占初始 scaffolds 序列的比例為 6.7% 。缺失的參考序列會導(dǎo)致比對偏倚利赋，或者街燈效應(yīng)水评，這將限制基因組學(xué)的研究。最近媚送，端粒到端粒（T2T）聯(lián)盟完成了人類單倍體基因組的第一個完整序列 T2T-CHM13中燥，提供了每個常染色體和X染色體的無縫組裝序列，部分核糖體DNA 序列仍有待完全解析塘偎。T2T-CHM13 直接改善了基因組的分析疗涉；例如拿霉，在與GRCh38不一致區(qū)域發(fā)現(xiàn)了370萬個額外的SNPs，它能更好地代表千人基因組計劃樣本真實的SNP和拷貝數(shù)變異咱扣。

雖然 T2T-CHM13 基因組代表了一項重大成就绽淘，但是沒有一個單獨的基因組可以代表人類物種遺傳的多樣性。由于參考基因組中缺少多態(tài)性結(jié)構(gòu)變異（SV）的替代等位基因闹伪，因此在使用短讀長測序數(shù)據(jù)和前期人類參考基因組的研究中沪铭，超過三分之二的SVs被遺漏了，而且單個SVs比單個SNV/INDELs 影響更大偏瓤。

為了克服單一參考基因組的偏差杀怠，研究人員已經(jīng)開始向泛基因組參考圖譜的過渡。過去幾年中厅克，泛基因組方法發(fā)展迅速赔退，因此現(xiàn)在提出使用泛基因組進行基因組分析是可行的。在這里已骇，文章對一組不同個體基因組進行了測序和組裝离钝，并提出了一個人類泛基因組草圖票编。2019年褪储，美國國家人類基因組研究所（NHGRI）成立人類泛基因組聯(lián)盟 HPRC，它的目標(biāo)是對350人個體的700個單倍型基因組進行組裝慧域，構(gòu)建全球基因組多樣性鲤竹。本篇文章發(fā)布的人類泛基因組草圖是這個計劃的一小部分。

3 組裝 47 個不同人類基因組

3.1 樣本選取和組裝策略

1昔榴、首先辛藻，研究人員從代表全球遺傳多樣性的基因組中選擇了47個全相二倍體組合，包括29個樣本互订，其長讀長測序數(shù)據(jù)完全由HPRC生成吱肌，另外18個樣本由其他測序方法獲得，見Fig1a仰禽。

2氮墨、研究團隊為每個樣本創(chuàng)建了一組一致的深度測序數(shù)據(jù)類型。所有HPRC樣本的數(shù)據(jù)包括PacBio公司的高保真數(shù)據(jù)（HiFi）和牛津納米孔（ONT）的長讀長數(shù)據(jù)吐葵、Bionano光學(xué)圖和高覆蓋率 Illumina短讀長測序规揪。為46個HPRC樣本生成了平均39.7×覆蓋深度的HiFi序列，HiFi讀取的N50值平均為19.6kb温峭。

3猛铅、組裝部分，文章選擇了 Trio-Hifiasm 軟件進行組裝凤藏。它可以利用家系父母Illumina 二代短序列 + 子代 PacBio HiFi 長序列組裝全相的單倍體基因組奸忽。 Trio-Hifiasm 軟件簡要介紹可參考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/283131167

3.2 組裝評估

1堕伪、研究人員首先搜索了較大規(guī)模的錯誤組裝，尋找基因復(fù)制錯誤栗菜、相位錯誤和染色體間錯誤連接刃跛，手動修復(fù)了3個大的復(fù)制錯誤和1個大的相位錯誤，并發(fā)現(xiàn)了217個假定的染色體間連接苛萎，這些連接中只有一個被人工確認為錯誤組裝桨昙，其余的連接涉及到染色體的短臂，這可能是錯位腌歉、非等位基因轉(zhuǎn)換或其他生物機制導(dǎo)致的結(jié)果蛙酪。

2、為了評估人工修正錯誤后的組裝結(jié)果翘盖，研究團隊開發(fā)了一個自動化的組裝質(zhì)量控制流程桂塞，該流程結(jié)合了可評估每個組裝的完整性、連續(xù)性馍驯、基本質(zhì)量和相位精度的方法阁危。含有X染色體的單倍體平均總長度為3.04 Gb，是含有X染色體的 T2T-CHM13（3.06 Gb）的99.3%汰瘫。包含一條Y染色體的單倍體平均總長度為2.93 Gb狂打，反映了性染色體之間的大小差異。NG50的平均值與GRCh38的連續(xù)NG50值相當(dāng)混弥。評估結(jié)果表明趴乡，該組裝流程具有高度的連續(xù)性和準(zhǔn)確性，見 Fig1c蝗拿。

3.3 區(qū)域組裝的可靠性

1晾捏、為了確定組裝的可靠性，文章開發(fā)了一個 read-based 的流程 Flagger 哀托，用于檢測不同類型的錯誤組裝惦辛。Flagger 的主要原理是將HiFi reads 比對至母系和父系單倍體基因組，如果reads的覆蓋率不一致仓手，這可能是由組裝錯誤導(dǎo)致的胖齐，見Fig1g
2、使用Flagger 流程俗或，最終確認了組中不可靠的區(qū)域只占0.88%市怎，見 Fig1h
3、通過對不可靠區(qū)域進行注釋辛慰，在不同重復(fù)區(qū)域的可靠性為：alpha 微衛(wèi)星區(qū)域（AlphaSat）為 95.4%区匠；人2/3微衛(wèi)星區(qū)域（Hsat2/3）為91.5%；片段重復(fù)區(qū)域（SDs）為 97.7%；可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)域（VNTRs）為94.3%驰弄；短串聯(lián)重復(fù)區(qū)域（STRs）為94.2%麻汰；人基因組區(qū)域重復(fù)為98.8%，見 Fig1i

3.4 組裝完整性和 CNV

1戚篙、為了評估組裝的完整性和拷貝數(shù)多態(tài)性五鲫，文章將組裝結(jié)果與 T2T-CHM13 參考基因組進行了比對。男性樣本的父系組裝約占 T2T-CHM13（去除X染色體） 的 92.8% 區(qū)域有至少一次的覆蓋岔擂，其他組裝（去除Y染色體）約占 T2T-CHM13 的 94.1% 區(qū)域有至少一次的覆蓋位喂。約有4.4%的 T2T-CHM13 參考基因組區(qū)域沒有任何覆蓋，這部分區(qū)域可能是沒有進行組裝或者是比對不可靠乱灵，見 Fig1j 塑崖。
2、這些未比對上的堿基大多分布于著絲粒的內(nèi)部和周圍

4 注釋 47 個不同人類基因組

1痛倚、文章開發(fā)了新的 Ensembl 映射流程利用GENCODE 數(shù)據(jù)庫注釋單倍體組裝的基因和轉(zhuǎn)錄組规婆。在每個HRPC 組裝基因組中平均鑒定出 99.07% 的蛋白質(zhì)編碼基因， 99.42% 的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本蝉稳，98.16%的非編碼基因抒蚜，98.96%的非編碼轉(zhuǎn)錄本，其中T2T-CHM13 參考基因組的注釋比例稍高耘戚，見Fig2a
2嗡髓、將HPRC注釋與組裝可靠性結(jié)果聯(lián)合分析，99.53%的基因和99.79%的轉(zhuǎn)錄組注釋發(fā)生在可靠區(qū)域內(nèi)毕莱，表明大多數(shù)注釋的轉(zhuǎn)錄組單倍型在結(jié)構(gòu)上是正確的器贩。為了檢測轉(zhuǎn)錄組堿基的準(zhǔn)確性，文章在一組標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中尋找無義和移碼突變朋截，發(fā)現(xiàn)每個組裝中有25個無義突變和72個移碼突變
3、有1115個蛋白質(zhì)編碼基因家族在Flagger 流程預(yù)測的組裝可靠區(qū)域內(nèi)吧黄，至少一個基因組的拷貝數(shù)增加部服，見Fig2b
4、相對于GRCh38拗慨，在預(yù)測的可靠性區(qū)域內(nèi)廓八，每個組裝平均有36個拷貝數(shù)增加的基因，傾向于是稀有低拷貝CNVs赵抢。具體來說剧蹂，71% 的CNV 基因出現(xiàn)在單倍型中。在以往依賴于 read 深度的研究中發(fā)現(xiàn)烦却，稀有CNVs 通常發(fā)生在注釋為富集SDs的區(qū)域之外宠叼，基因組組裝序列分析CNVs，證實了這一觀察結(jié)果
5、總體而言冒冬，58個基因在10%或更多的單倍體組合中是CNVs伸蚯，相對于GRCh38，大多數(shù)個體擴增了16個基因简烤，其中許多基因具有高度拷貝數(shù)多態(tài)性剂邮，是復(fù)雜串聯(lián)重復(fù)的一部分，見 Fig2de
6横侦、GPRIN2 基因和 SPDYE2 基因都在串聯(lián)重復(fù)區(qū)發(fā)生了拷貝數(shù)擴增挥萌，見 Fig2fg

5 構(gòu)建泛基因組草圖

1、文章使用序列圖對泛基因組進行表示枉侧，其中節(jié)點對應(yīng)DNA片段瑞眼。每個節(jié)點有兩種可能的方向，正向和反向棵逊，任意一對節(jié)點之間有4種可能的方向組合伤疙。單倍型序列可能代表圖中的任一路線，見 Fig3a
2辆影、生成代表性泛基因組是一個活躍的研究領(lǐng)域徒像。這個問題并不簡單，既有計算上的挑戰(zhàn)（有數(shù)千億的堿基需要進行比對）蛙讥，也有比對上的問題锯蛀，需要確認正確的比對，特別是在重復(fù)區(qū)域次慢。
文章此項目中使用了3種不同的圖構(gòu)建方法：Minigraph旁涤，Minigraph-Cactus(MC)，PanGenome Graph Builder(PGGB)迫像，見 Extended Data Fig3
（1）Minigraph 從一個組裝好的參考基因組 GRCh38 開始構(gòu)建泛基因組劈愚，并迭代添加其他的組裝區(qū)域，僅記錄大于50bp的SVs闻妓。它允許納入復(fù)雜變異菌羽，包括重復(fù)和翻轉(zhuǎn)
（2）MC 擴展了 Minigraph 構(gòu)建的泛基因組，使用 Cactus 基因組比對軟件對兩個組裝片段之間的同源關(guān)系進行了堿基水平的比對
（3）PGGB 從all-to-all 組裝比對中構(gòu)建了一個泛基因組由缆。PGGB 圖并不基于所選的參考基因組注祖，盡管 T2T-CHM13 和 GRCh38 的contigs 都被用于構(gòu)建染色體

5.1 檢測泛基因組變異

1、Minigraph 圖是最小的均唉，為3.24GB是晨。由于受結(jié)構(gòu)突變的限制，它的節(jié)點和邊的數(shù)量與基本水平的圖相比要小兩個數(shù)量級舔箭；MC 圖為 3.29GB罩缴，相比于Minigraph ，它增加了一些微小變異的區(qū)域；PGGB 圖包含大概 5GB 的序列靴庆，因為它包含了其他方法排除的高度結(jié)構(gòu)化的微衛(wèi)星區(qū)域时捌，并且沒有對組裝的 contigs 進行修剪和過濾
2、為了描述泛基因組圖中的變異炉抒，文章使用圖分解來識別對應(yīng)非重疊變異位點的“氣泡”子圖奢讨，然后將變異位點分為不同類型的小變異（<50bp）和 SVs（≥50bp）。
3焰薄、文章發(fā)現(xiàn)不同泛基因組中每種類型的突變數(shù)目相似拿诸，其中MC 圖中有2200萬個微小變異，PGGB中有2100萬個微小變異塞茅，見Fig3b亩码；MC圖有 67000個SVs，PGGB有73000個SVs野瘦，Minigraph有 75000 個SVs描沟，見Fig3c
4、通過在圖中追蹤每個個體組合的路徑來評估其變異鞭光，并在Dipcall定義的基因組區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了相似數(shù)量的小變異和SV吏廉，在MC圖中，每個樣本有534萬個小變異惰许，每個單倍型平均有16,800個SV席覆，見Fig3ef
5、在MC圖中汹买，在SV 位點上共有 90 Mb的非參考基因序列佩伤，不包括難以比對的著絲粒重復(fù)序列。Alu, L1和ERV SVs主要表現(xiàn)為雙等位基因晦毙，而VNTRs 通常在每個位點有三個或更多不同的等位基因生巡。雙等位基因變異的泛基因組中的次要 AF 與SNP以及L1、Alu和VNTR變異相似结序，盡管VNTRs變異向更常見的等位基因略有轉(zhuǎn)移障斋，見Fig3d
6、文章量化了44個二倍體基因組中每個基因組對泛基因組增量貢獻的常染色體非參比序列的數(shù)量徐鹤，使用MC圖和PGGB圖，見Fig3h

1邀层、為了進一步探索變異檢測的質(zhì)量返敬，文章對比了基于傳統(tǒng)的GRCh38和基于泛基因組的變異比較。將泛基因組中的小變異與SVs 與基于參考基因組的集合進行了比較寥院，發(fā)現(xiàn)結(jié)果高水平一致性劲赠，見Fig4abc。
2、此外凛澎，泛基因組草圖在捕捉基因組變異方面的表現(xiàn)比基準(zhǔn)方法結(jié)果要好霹肝，見 Supplementray Fig8。

5.2 泛基因組代表性的復(fù)雜基因組位點

1塑煎、復(fù)雜的多等位基因SVs很難基于參考基因組的方法進行比對沫换。為了篩選復(fù)雜的SVs，文章從 Minigraph 中找到了在組裝的單倍型中至少出現(xiàn)5個結(jié)構(gòu)等位基因的>10 kb的氣泡最铁。由于比對和低覆蓋的原因讯赏，之前短序列檢測SVs的方法在這些位點是不準(zhǔn)確的，這里文章以單堿基分辨率解決了結(jié)構(gòu)問題冷尉。
2漱挎、在 RHD-RHCE 復(fù)雜SVs中，除了先前描述的單倍型外雀哨，還檢出了5個新的單倍型磕谅，見Fig5a-c。在HLA-A 周圍雾棺，先前已經(jīng)描述了兩個缺失等位基因膊夹，但先前未報道攜帶HLA-Y假基因插入等位基因。HLA-Y基因插入（65kb）出現(xiàn)頻率較高（28%）垢村，但是與GRCh38的同源性較小割疾，見Fig5d-f

6 泛基因組的應(yīng)用

6.1 基于泛基因組檢測微小變異

1、文章建立泛參考基因組旨在消除使用單一線性參考基因組（GRCh38和CHM13）造成的比對偏倚嘉栓，從而廣泛的改善下游分析流程宏榕。文章進行了初始測試，解釋了為什么使用泛基因組進行比對可以改善短 reads 檢測微小變異的準(zhǔn)確性侵佃。以下是不同比對軟件麻昼，參考基因組和變異檢測軟件的組合，最終結(jié)果顯示泛基因組組合（Giraffe + DeepVariant）在檢測微小變異方面表現(xiàn)更好馋辈，見Fig6ab
（1）比對Giraffe + MC泛基因組 + 變異檢測（DeepVariat / Deep Trio）
（2）比對DragenGRAPH + GRCh38基因組 + 變異檢測（Dragen / Deep Trio）
（3）比對BWAMEM + GRCh38基因組 + 變異檢測（DeepVariant / Deep Trio）
2抚芦、使用泛基因組進行比對可以使很多區(qū)域受益，但受益最大的區(qū)域是GRCh38中的錯誤區(qū)域以及大的 L1HS 序列區(qū)域

6.2 泛基因組變異資源

1迈螟、為了創(chuàng)建社區(qū)資源叉抡，幫助開發(fā)基于泛基因組群體遺傳學(xué)的方法，文章使用Giraffe 對 1KG 計劃的3202 個高深度短序列的樣本進行了比對答毫，并使用DeepVariant 軟件對變異進行了分析褥民。與 1KG 計劃檢測出的變異相比，使用泛基因組每個樣本平均多出 64000 個變異洗搂，見Extended Data Fig7a
2消返、通過檢測 1KG 計劃樣本的突變载弄，為遺傳學(xué)和基因組學(xué)社區(qū)提供了復(fù)雜基因位點的頻率信息。例如撵颊，使用泛基因組學(xué)的方法可以檢測到覆蓋RHCE基因第二外顯子的轉(zhuǎn)換突變宇攻，這種單倍型發(fā)生的概率為25%；對于 KCNE1基因倡勇，泛基因組的方法可以檢測跨越3個外顯子逞刷，40kb 區(qū)域的變異和頻率，但是這個區(qū)域在GRCh38 中由于存在錯誤的重復(fù)译隘，之前無法評估亲桥。

6.3 SV分型

1、 SV 多態(tài)性是基于圖的泛基因參考基因組的一個關(guān)鍵優(yōu)勢固耘。為了展示泛基因組固有的SVs的分辨效果题篷，使用 PanGenie 對 MC 圖進行了基因分型。通過對 1KG 計劃的3202個樣本進行分型厅目，最終產(chǎn)生了一個過濾后番枚、高質(zhì)量的分型數(shù)據(jù)集，包括28434個缺失等位基因损敷，84752個插入等位基因葫笼，26439個其他等位基因。對比 1KG 計劃樣本和 HPRC 泛基因組樣本計算的AFs拗馒，兩者具有較高的皮爾遜相關(guān)性路星，見Fig6c 。
2诱桂、為了對比多檢出泛基因組方法多檢出 SVs 的能力洋丐，對 HPRC PanGenie filtered ,HGSVC PanGenie lenient , 1KG Illumina calls 進行了對比。HPRC 的方法檢出了更多的SVs挥等，特別是在 deletions 小于300bp友绝，見Fig6de。

7 討論

1肝劲、文章發(fā)布了來自47個不同個人的94個從頭組裝單倍型迁客。這是一套完全分相的人組裝基因組，并在組裝質(zhì)量上優(yōu)于之前水平辞槐，這源于更好的測序技術(shù)和從頭組裝算法
2掷漱、這里介紹的泛基因組是一組不同個人單倍型組裝基因組的組合，這種組合也可以稱為是變異的圖譜榄檬。這里呈現(xiàn)的泛基因組可以使用壓縮的 GFA 二級制格式進行無損存儲切威，僅為 3-6 Gb，含有超過2820 億個堿基序列丙号。
3先朦、文章對復(fù)雜區(qū)域和醫(yī)學(xué)相關(guān)區(qū)域的研究表明，泛基因組可以真實地概括現(xiàn)有的知識犬缨，更有利于發(fā)現(xiàn)與人類疾病相關(guān)的復(fù)雜變異喳魏。
4、泛參考基因組的近期應(yīng)用是可以改進參考基因組相關(guān)的比對流程怀薛。在這些工作流程中刺彩，泛基因組可以作為現(xiàn)有參考基因組的替代，供下游處理枝恋。即 Giraffe 比對 + DeepVariant 檢測變異流程创倔。DeepVariant 軟件本身不需要考慮泛基因組的復(fù)雜性，但是比對步驟可以改善線性參考基因組中的缺失序列焚碌。與使用標(biāo)準(zhǔn)參考基因組相比畦攘，使用泛基因組并沒有顯著增加計算成本，而假陽和假陰性錯誤平均減少了34%十电，特別是在基因組復(fù)雜區(qū)域知押。
5、泛基因組相比之前的線性基因組能更好的檢測SVs鹃骂，可以更好的改善短序列檢測SVs台盯。在未來，泛基因組加低成本長reads 可能是SV 綜合基因分型的有效組合畏线。
6静盅、目前發(fā)布參考基因組草圖還存在一些不足和挑戰(zhàn)。如HRPC組裝錯配序列比 T2T-CHM13 序列多一個數(shù)量級寝殴。目前納入的隊列人數(shù)還比較小蒿叠，近期會將泛基因組隊列擴展至350人。該項目的部分價值將在于未來為人們?nèi)绾尾蹲阶儺惗鄻有越⑿碌臉?biāo)準(zhǔn)杯矩，以實現(xiàn)建立一個共同的全球參考資源的宏偉目標(biāo)栈虚。

8 參考

[1] Liao, WW., Asri, M., Ebler, J. et al. A draft human pangenome reference. Nature 617, 312–324 (2023).
https://mp.weixin.qq.com/s/YMCEDc4VplfjhvdtZE4EUw
https://zhuanlan.zhihu.com/p/283131167