在RNA水平旨怠，核酸編輯可以修復(fù)疾病相關(guān)的序列產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)，這有望治療遺傳疾病蜈块。VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)包含可編程的單效應(yīng)RNA引導(dǎo)的RNase Cas13鉴腻。在這里，研究者對(duì)VI型系統(tǒng)進(jìn)行了分析百揭，以設(shè)計(jì)出一種能夠穩(wěn)健敲除的Cas13直系同源物爽哎，并通過(guò)使用催化失活的Cas13將腺苷轉(zhuǎn)為肌苷脫氨酶活性通過(guò)ADAR2引導(dǎo)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄物來(lái)證明RNA編輯。該系統(tǒng)被稱為可編程A到I替換的RNA編輯（REPAIR）器一，沒(méi)有嚴(yán)格的序列限制课锌，可用于編輯包含致病性突變的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。研究者進(jìn)一步設(shè)計(jì)該系統(tǒng)祈秕，以創(chuàng)建高特異性變體REPAIRv2渺贤，該變體的特異性是REPAIRv1的919倍，并最小化該系統(tǒng)以減輕病毒傳播踢步。REPAIR為研究癣亚、治療和生物技術(shù)提供了一個(gè)前景廣闊的RNA編輯平臺(tái)。

綜述

精確的核酸編輯技術(shù)對(duì)于研究細(xì)胞功能和作為新的治療方法是有價(jià)值的获印。當(dāng)前的編輯工具基于可編程核酸酶述雾，如原核簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）相關(guān)核酸酶Cas9（1-4）或Cpf1（5），這反過(guò)來(lái)通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或通過(guò)模板依賴同源定向修復(fù)（HDR）的精確基因編輯來(lái)驅(qū)動(dòng)靶向基因斷裂（6）兼丰。NHEJ利用在分裂細(xì)胞和有絲分裂后細(xì)胞中都活躍的宿主機(jī)制玻孟，并通過(guò)產(chǎn)生插入或缺失（indel）突變的混合物來(lái)提供有效的基因破壞。相比之下鳍征，HDR是由宿主機(jī)制介導(dǎo)的黍翎，其表達(dá)主要局限于復(fù)制細(xì)胞。因此艳丛，開發(fā)有絲分裂后細(xì)胞的基因編輯能力仍然是一個(gè)主要挑戰(zhàn)匣掸。由Cas9尼克酶和胞苷脫氨酶之間的融合組成的DNA堿基編輯器可以在靶窗內(nèi)介導(dǎo)有效的胞苷到尿苷的轉(zhuǎn)化趟紊，并顯著減少雙鏈斷裂誘導(dǎo)的indels的形成（7，8）碰酝。然而霎匈，DNA堿基編輯的潛在靶向位點(diǎn)受限于Cas9對(duì)編輯位點(diǎn)原間隔物相鄰基序（PAM）的要求（9）。在此送爸，研究者描述了使用VI型CRISPR相關(guān)RNA引導(dǎo)的RNA酶Cas13（10-13）開發(fā)精確靈活的RNA堿基編輯技術(shù)铛嘱。

Cas13酶具有兩個(gè)高級(jí)真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合（HEPN）內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，它們介導(dǎo)精確的RNA切割袭厂，優(yōu)先選擇在生物化學(xué)和細(xì)菌中觀察到的具有原間隔物側(cè)翼位點(diǎn)（PFS）基序的靶（10墨吓，11）。迄今已鑒定出三個(gè)Cas13蛋白家族：Cas13a（以前稱為C2c2）纹磺、Cas13b和Cas13c（12帖烘，13）。研究者最近報(bào)道爽航，Cas13a酶可以用作核酸檢測(cè)（14）以及哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞RNA敲除和轉(zhuǎn)錄物追蹤（15）的工具蚓让。有趣的是乾忱，RNA干擾Cas13a不需要生物化學(xué)PFS（15）讥珍。Cas13酶的可編程性質(zhì)使其成為開發(fā)RNA結(jié)合和干擾應(yīng)用工具的一個(gè)有吸引力的起點(diǎn)。

作用于RNA（ADAR）家族酶的腺苷脫氨酶通過(guò)腺苷水解脫氨化為肌苷（一種在翻譯和剪接功能上等同于鳥苷的核堿）介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)源性編輯（16窄瘟，17）拳球。有兩個(gè)功能性的人ADAR同源基因ADAR1和ADAR2肛冶，它們由N端雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端催化脫氨基結(jié)構(gòu)域組成。ADAR1和ADAR2的內(nèi)源性靶位點(diǎn)包含大量的雙鏈同一性，催化結(jié)構(gòu)域需要雙鏈區(qū)域勘高，以便在體外和體內(nèi)進(jìn)行有效編輯（18，19）渤早。重要的是卤材，ADAR催化結(jié)構(gòu)域能夠在體外無(wú)任何蛋白質(zhì)輔因子的情況下脫氨靶腺苷（20）。已發(fā)現(xiàn)ADAR1主要針對(duì)重復(fù)區(qū)域竣况，而ADAR2主要針對(duì)非重復(fù)編碼區(qū)域（17）克婶。盡管ADAR蛋白具有可限制靶向潛在靈活性的優(yōu)選編輯基序，但超活性突變體丹泉，如ADAR2（E488Q）（21）情萤，可以放松序列限制，提高腺苷對(duì)肌苷的編輯率摹恨。ADAR優(yōu)先對(duì)RNA雙鏈體中與胞苷堿基錯(cuò)配的腺苷脫氨化（22）筋岛，為精確的堿基編輯提供了一個(gè)有希望的機(jī)會(huì)。盡管先前的方法已經(jīng)通過(guò)RNA導(dǎo)向器設(shè)計(jì)了靶向ADAR融合（23-26）晒哄，但尚未報(bào)道這些方法的特異性睁宰，它們各自的靶向機(jī)制依賴于RNA-RNA雜交肪获，而無(wú)需蛋白伴侶的幫助，這可能會(huì)增強(qiáng)靶向識(shí)別和嚴(yán)格性柒傻。

在這里贪磺，研究者測(cè)定了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA敲除活性的Cas13酶家族的一個(gè)子集，并鑒定了Prevotella sp.P5-125（PspCas13b）的Cas13b同源物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用中最有效和最特異的诅愚。然后寒锚，研究者將ADAR2脫氨酶結(jié)構(gòu)域（ADAR2DD）與催化失活的PspCas13b融合，并證明RNA編輯可編程A到I（G）替換（REPAIR）報(bào)告和內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物以及與疾病相關(guān)的突變违孝。最后刹前，研究者采用了一種合理的誘變方案來(lái)提高dCas13b-ADAR2DD融合的特異性，以產(chǎn)生具有919倍以上特異性的REPAIRv2雌桑。

結(jié)果

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Cas13家族成員

研究者之前開發(fā)了用于哺乳動(dòng)物敲除應(yīng)用的LwaCas13a喇喉，但它需要單體超折疊GFP（msfGFP）穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域來(lái)有效敲除，盡管特異性很高校坑，但敲除水平并不始終低于50%（15）拣技。研究者試圖通過(guò)表征一組具有遺傳多樣性的Cas13家族成員，以評(píng)估其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的RNA敲除活性耍目，來(lái)鑒定一種更穩(wěn)健的RNA靶向CRISPR系統(tǒng)（圖1A）膏斤。研究者生成了多種Cas13蛋白的哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化版本，包括21個(gè)Cas13a的同源基因邪驮、15個(gè)Cas13b的同源基因和7個(gè)Cas13c的同源基因莫辨，并將它們克隆到具有N端和C端核輸出信號(hào)（NES）序列和C端msfGFP的表達(dá)載體中，以增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性（補(bǔ)充表1）毅访。為了測(cè)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的干擾沮榜，研究者設(shè)計(jì)了一種雙報(bào)告構(gòu)建體，在單獨(dú)的啟動(dòng)子下表達(dá)獨(dú)立的Gaussia（Gluc）和Cypridinia（Cluc）熒光素酶喻粹，這允許一種熒光素酶作為Cas13干擾活性的測(cè)量蟆融，另一種作為內(nèi)部對(duì)照。對(duì)于每個(gè)Cas13同源物守呜，研究者使用氨芐青霉素干擾試驗(yàn)（圖S1型酥；補(bǔ)充表2；補(bǔ)充信息）得出的Cas13b PFS基序和先前Cas13a活性報(bào)告中的3'H（非G）PFS設(shè)計(jì)了原間隔物側(cè)翼位點(diǎn)（PFS）兼容的導(dǎo)向RNA（10）弛饭。

研究者用Cas13表達(dá)冕末、引導(dǎo)RNA和報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，然后在48小時(shí)后量化Cas13表達(dá)水平和靶向Gluc（圖1B侣颂，圖S2A）档桃。測(cè)試每個(gè)Cas13同源物的兩個(gè)引導(dǎo)RNA揭示了一系列活性水平，包括五個(gè)Cas13b同源物憔晒，相對(duì)于最近表征的LwaCas13a藻肄，兩個(gè)引導(dǎo)RNAs的干擾相似或增加（圖1B）蔑舞，研究者觀察到Cas13表達(dá)和干擾活性之間只有微弱的相關(guān)性（圖S2B–D）。研究者選擇了排名前五的Cas13b正交測(cè)井儀嘹屯，以及排名前兩的Cas13a正交測(cè)井儀進(jìn)行進(jìn)一步的工程設(shè)計(jì)攻询。

接下來(lái)，研究者測(cè)試了不含msfGFP的Cas13介導(dǎo)的Gluc的敲除州弟，以選擇不需要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的同源物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的活性钧栖。研究者假設(shè)Cas13活性可能受到亞細(xì)胞定位的影響，正如研究者先前報(bào)道的LwaCas13a的優(yōu)化（15）婆翔。因此拯杠，研究者測(cè)試了七個(gè)選擇的Cas13同源物C端融合到六個(gè)不同定位標(biāo)簽之一的干擾活性，而不含msfGFP啃奴。使用熒光素酶報(bào)告物分析潭陪，研究者確定了干擾活性最高的前三個(gè)Cas13b設(shè)計(jì)：來(lái)自Prevotella sp.P5-125（PspCas13b）的Cas13b和來(lái)自與HIV Rev基因NES融合的古斑紫菜（PguCas13b）C端的Cas13a和來(lái)自鴨疫里氏桿菌（RanCas13b，C端與MAPK NES融合（圖S3A）最蕾。為了進(jìn)一步區(qū)分頂部同源物的活性水平依溯，研究者將三種優(yōu)化的Cas13b構(gòu)建體與優(yōu)化的LwaCas13a-msfGFP融合體以及shRNA進(jìn)行了比較，以了解它們使用位置匹配指南敲低內(nèi)源性KRAS轉(zhuǎn)錄物的能力（圖S3B）瘟则。研究者觀察到PspCas13b的最高水平干擾（平均敲除率為62.9%）黎炉，因此選擇該干擾與LwaCas13a進(jìn)行進(jìn)一步比較。

為了更嚴(yán)格地定義PspCas13b和LwaCas13a的活性壹粟，研究者設(shè)計(jì)了沿著Gluc和Cluc轉(zhuǎn)錄物的位置匹配指南拜隧，并使用研究者的熒光素酶報(bào)告物測(cè)定法測(cè)定了它們的活性宿百。研究者分別測(cè)試了93個(gè)和20個(gè)針對(duì)Gluc和Cluc的位置匹配指南趁仙，并發(fā)現(xiàn)PspCas13b相對(duì)于LwaCas13a的敲除水平持續(xù)增加（PspCas13 b的平均敲除率為92.3%，而LwaCas13a的平均敲減率為40.1%）（圖1C垦页，D）雀费。

圖1 鑒定RNA敲除的高活性Cas13b同源基因

Cas13的干擾特異性

為了表征PspCas13b和LwaCas13a的干擾特異性，研究者設(shè)計(jì)了一個(gè)熒光素酶靶的質(zhì)粒庫(kù)痊焊，其包含整個(gè)靶序列和三個(gè)側(cè)翼5’和3’堿基對(duì)的單錯(cuò)配和雙錯(cuò)配（圖S3C）盏袄。研究者用LwaCas13a或PspCas13b轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，這是一種靶向未修飾靶序列的固定導(dǎo)向RNA薄啥，以及與適當(dāng)系統(tǒng)相對(duì)應(yīng)的錯(cuò)配靶文庫(kù)辕羽。然后，研究者對(duì)未分離的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行靶向RNA測(cè)序垄惧，以量化失配靶序列的缺失刁愿。研究者發(fā)現(xiàn)，LwaCas13a和PspCas13b的中心區(qū)域?qū)蝹€(gè)失配相對(duì)不耐受到逊，從PspCas13 b靶的12–26堿基對(duì)延伸到LwaCas13 a靶的13–24堿基對(duì)（圖S3D）铣口。與單突變相比滤钱，雙失配的耐受性甚至更低，在更大的窗口內(nèi)幾乎沒(méi)有觀察到敲除活性脑题，從PspCas13b的12–29堿基對(duì)和LwaCas13a的8–27堿基對(duì)延伸到它們各自的靶點(diǎn)（圖S3E）件缸。此外，由于靶序列5'和3'端側(cè)翼的三個(gè)核苷酸存在失配叔遂，研究者可以評(píng)估PFS對(duì)Cas13敲除活性的限制他炊。測(cè)序表明，幾乎所有的PFS組合都允許穩(wěn)健的敲除已艰，這表明無(wú)論是哪種酶佑稠，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的干擾都可能不存在PFS限制。這些結(jié)果表明旗芬，Cas13a和Cas13b顯示出相似的序列約束和對(duì)失配的敏感性舌胶。

研究者接下來(lái)描述了PspCas13b和LwaCas13a在轉(zhuǎn)錄組mRNA部分的干擾特異性。研究者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組范圍的mRNA測(cè)序疮丛，以檢測(cè)顯著的差異表達(dá)基因幔嫂。LwaCas13a和PspCas13b顯示了Gluc的強(qiáng)大敲除（圖1E，F(xiàn)）誊薄，并且與位置匹配的shRNA相比具有高度特異性履恩，shRNA顯示了數(shù)百個(gè)非靶點(diǎn)（圖1G），這與研究者先前對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中LwaCas13 a特異性的描述一致（15）呢蔫。

Cas13-ADAR靶向RNA編輯

鑒于PspCas13b在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了一致切心、穩(wěn)健和特異性的mRNA敲除，研究者設(shè)想它可以作為RNA結(jié)合平臺(tái)來(lái)招募RNA修飾結(jié)構(gòu)域片吊，如ADAR的脫氨酶結(jié)構(gòu)域（ADARDD）绽昏，用于可編程RNA編輯。為了設(shè)計(jì)缺乏核酸酶活性的PspCas13b（dPspCas13b俏脊，以下稱為dCas13b）全谤，研究者突變了HEPN結(jié)構(gòu)域中的保守催化殘基，并觀察到熒光素酶RNA敲除的損失（圖S4A）爷贫。研究者假設(shè)dCas13b-ADARDD融合體可以被引導(dǎo)RNA招募到靶向腺苷认然，雜交RNA產(chǎn)生ADAR活性所需的雙鏈底物（圖2A）。為了提高靶腺苷脫氨率漫萄，研究者對(duì)最初的RNA編輯設(shè)計(jì)進(jìn)行了兩項(xiàng)額外的修改：研究者引入了與靶腺苷相對(duì)的錯(cuò)配胞苷卷员，此前有報(bào)道稱其可增加脫氨頻率，并將dCas13b與含有超活化突變的人ADAR1或ADAR2的脫氨酶結(jié)構(gòu)域融合以增強(qiáng)催化活性（ADAR1DD（E1008Q）（27）或ADAR2DD（E488Q）（21））腾务。

為了測(cè)試dCas13b ADARDD的活性毕骡，研究者通過(guò)引入無(wú)義突變（W85X（UGG->UAG））在Cluc上生成了一個(gè)RNA編輯報(bào)告子，該突變可以通過(guò)a->I編輯在功能上修復(fù)為野生型密碼子（圖2B），然后作為Cluc發(fā)光的恢復(fù)進(jìn)行檢測(cè)挺峡。研究者在靶腺苷上用長(zhǎng)度為30葵孤、50、70或84個(gè)核苷酸的間隔物均勻平鋪引導(dǎo)物橱赠，以確定最佳引導(dǎo)物放置和設(shè)計(jì)（圖2C）尤仍。研究者發(fā)現(xiàn)，dCas13b-ADAR1DD需要更長(zhǎng)的導(dǎo)管來(lái)修復(fù)Cluc報(bào)告器狭姨，而dCas13b-ADAR2DD在所有導(dǎo)管長(zhǎng)度測(cè)試時(shí)都能正常工作（圖2C）宰啦。研究者還發(fā)現(xiàn)，由于野生型ADAR2DD的熒光素酶修復(fù)減少饼拍，過(guò)度活躍的E488Q突變提高了編輯效率（圖S4B）赡模。從這一活性證明中，研究者選擇dCas13b-ADAR2DD（E488Q）進(jìn)行進(jìn)一步表征师抄，并將此方法命名為RNA編輯用于可編程A到I替換版本1（REPAIRv1）漓柑。

為了驗(yàn)證熒光素酶活性的恢復(fù)是由于真實(shí)的編輯事件，研究者通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和靶向下一代測(cè)序直接測(cè)量了REPAIRv1介導(dǎo)的Cluc轉(zhuǎn)錄物編輯叨吮。研究者測(cè)試了目標(biāo)部位周圍的30和50 nt間隔物辆布，發(fā)現(xiàn)兩種引導(dǎo)長(zhǎng)度都產(chǎn)生了預(yù)期的A到I編輯，50 nt間隔器實(shí)現(xiàn)了更高的編輯百分比（圖2D茶鉴，E锋玲，圖S4C）。研究者還觀察到涵叮，50個(gè)nt間隔物在測(cè)序窗口內(nèi)的非靶向腺苷處編輯的傾向增加惭蹂，這可能是由于雙鏈RNA的區(qū)域增加（圖2E，圖S4C）割粮。

接下來(lái)盾碗，研究者將靶向內(nèi)源性基因PPIB。研究者設(shè)計(jì)了50個(gè)nt間隔物平鋪PPIB穆刻，并發(fā)現(xiàn)研究者可以以高達(dá)28%的編輯效率編輯PPIB轉(zhuǎn)錄物（圖S4D）置尔。為了測(cè)試REPAIR是否可以進(jìn)一步優(yōu)化，研究者修改了dCas13b和ADAR2DD（E488Q）之間的連接子（圖S4E氢伟，補(bǔ)充表3），并發(fā)現(xiàn)連接子的選擇適度影響了熒光素酶活性的恢復(fù)幽歼。此外朵锣，研究者測(cè)試了dCas13b和guide單獨(dú)介導(dǎo)編輯事件的能力，發(fā)現(xiàn)編輯需要ADAR脫氨酶結(jié)構(gòu)域（圖S5A–D）甸私。

圖2 用于RNA編輯的dCas13b-ADAR

定義RNA編輯序列

考慮到研究者可以在測(cè)試點(diǎn)實(shí)現(xiàn)精確的RNA編輯诚些，研究者想描述針對(duì)轉(zhuǎn)錄組中任何RNA靶點(diǎn)編程系統(tǒng)的序列約束。序列限制可能來(lái)自dCas13b靶向限制，如PFS诬烹，或ADAR序列偏好（28）砸烦。為了研究對(duì)REPAIRv1的PFS限制，研究者設(shè)計(jì)了一個(gè)質(zhì)粒庫(kù)绞吁，在Cluc轉(zhuǎn)錄物的靶位點(diǎn)的5'端攜帶一系列四個(gè)隨機(jī)核苷酸（圖3A）幢痘。研究者以UAG或AAC基序中的中心腺苷為目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于這兩個(gè)基序家破，所有PFS都顯示出可檢測(cè)到的RNA編輯水平颜说，大多數(shù)PFS在目標(biāo)位點(diǎn)的編輯率超過(guò)50%（圖3B）。接下來(lái)汰聋，研究者試圖確定REPAIRv1中的ADAR2DD是否有任何序列限制直接位于目標(biāo)堿基的側(cè)翼门粪，如先前關(guān)于ADAR2DD的報(bào)道（28）。研究者測(cè)試了直接圍繞靶腺苷的5'和3'側(cè)翼核苷酸的每種可能組合（圖3C）烹困，并發(fā)現(xiàn)REPAIRv1能夠編輯所有基序（圖3D）玄妈。最后，研究者分析了間隔序列中與靶A相對(duì)的堿基的身份是否影響了編輯效率髓梅，并發(fā)現(xiàn)A–C錯(cuò)配具有最高的熒光素酶恢復(fù)措近，與先前關(guān)于ADAR2活性的報(bào)道一致，其中A–G女淑、A–U和A-A顯著降低了REPAIRv1活性（圖S5E）瞭郑。

圖3 使用REPAIRv1工具測(cè)量RNA編輯的序列靈活性

使用REPAIRv1糾正與疾病相關(guān)的人類突變

為了證明REPAIRv1系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA編輯中的廣泛適用性，研究者設(shè)計(jì)了針對(duì)兩種疾病相關(guān)突變的REPAIRv1指南：X連鎖腎病性尿崩癥中的878G>A（AVPR2 W293X）和范科尼貧血中的1517G>A（FANCC W506X）鸭你。研究者將攜帶這些突變的基因的cDNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293FT細(xì)胞中屈张，并測(cè)試REPAIRv1是否能糾正突變。使用含有50個(gè)nt間隔物的引導(dǎo)RNA袱巨，研究者能夠?qū)崿F(xiàn)AVPR2的35%校正和FANCC的23%校正（圖4A–D）阁谆。然后，研究者測(cè)試了REPAIRv1糾正34種不同疾病相關(guān)G>A突變的能力（補(bǔ)充表4）愉老，發(fā)現(xiàn)研究者能夠在33個(gè)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)顯著編輯场绿，編輯效率高達(dá)28%（圖4E）。研究者選擇的突變只是ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中致病性G到a突變（5739）的一部分嫉入，其中還包括額外的11943個(gè)G到a變體（圖4F和圖S6）焰盗。由于沒(méi)有序列限制（圖3），REPAIRv1能夠潛在地編輯所有這些與疾病相關(guān)的突變咒林，特別是考慮到研究者觀察到的編輯與目標(biāo)基序無(wú)關(guān)（圖3C和圖4G）熬拒。

向患病細(xì)胞遞送REPAIRv1系統(tǒng)是治療用途的先決條件，因此研究者尋求設(shè)計(jì)可包裝成治療相關(guān)病毒載體（如腺相關(guān)病毒（AAV）載體）的REPAIRv1構(gòu)建體垫竞。AAV載體的包裝極限為4.7kb澎粟，不能容納大尺寸的dCas13b-ADARDD（4473bp）以及啟動(dòng)子和表達(dá)調(diào)控元件。為了減小尺寸，研究者測(cè)試了與ADAR2DD（E488Q）融合的dCas13的各種N端和C端截短片段的RNA編輯活性活烙。研究者發(fā)現(xiàn)徐裸，所有測(cè)試的C端截短仍然具有功能，能夠恢復(fù)熒光素酶信號(hào)（圖S7）啸盏，最大的截短重贺，C端Δ984-1090（融合蛋白4152bp的總大小）足夠小宫补，足以適合AAV載體的包裝限制檬姥。

圖4 用REPAIRv1糾正疾病相關(guān)突變

REPAIRv1的轉(zhuǎn)錄組特異性

盡管在研究者的熒光素酶平鋪實(shí)驗(yàn)中，用PspCas13b敲除RNA具有高度特異性粉怕，但研究者在指南中觀察到脫靶腺苷編輯：靶雙鏈（圖2E）健民。為了了解這是否是一種普遍現(xiàn)象，研究者平鋪了內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物KRAS贫贝，并測(cè)量了靶腺苷附近的脫靶編輯程度（圖5A）秉犹。研究者發(fā)現(xiàn)，對(duì)于KRAS稚晚，雖然目標(biāo)編輯率為23%崇堵，但目標(biāo)站點(diǎn)周圍有許多站點(diǎn)也具有可檢測(cè)到的A到I編輯（圖5B）。

由于在指南：靶雙鏈中觀察到了脫靶編輯客燕，研究者最初通過(guò)對(duì)12.5X覆蓋率的所有mRNA進(jìn)行RNA測(cè)序來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)錄組廣泛脫靶鸳劳。在轉(zhuǎn)錄組的所有編輯位點(diǎn)中，目標(biāo)編輯位點(diǎn)的編輯率最高也搓，A到I轉(zhuǎn)換率為89%赏廓。研究者還發(fā)現(xiàn)，存在大量的a到I偏離目標(biāo)事件傍妒，1732個(gè)偏離目標(biāo)處于目標(biāo)導(dǎo)向條件幔摸，925個(gè)偏離目標(biāo)位于非目標(biāo)導(dǎo)向條件下，828個(gè)偏離靶在目標(biāo)導(dǎo)向和非目標(biāo)導(dǎo)向情況下共享（圖5C颤练，D）既忆。鑒于目標(biāo)導(dǎo)向和非目標(biāo)導(dǎo)向條件之間存在大量重疊的偏離目標(biāo)，研究者推斷偏離目標(biāo)可能來(lái)自ADARDD嗦玖。為了驗(yàn)證這一假設(shè)患雇，研究者重復(fù)了Cluc靶向?qū)嶒?yàn)踏揣，這次比較了REPAIRv1與靶向指南庆亡、REPAIRv1和非靶向指南的轉(zhuǎn)錄組變化捞稿、單獨(dú)的REPAIRv1或單獨(dú)的ADARDD（E488Q）（圖S8）。研究者在每種情況下都發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的基因和脫靶編輯事件（圖S8B任斋，C）耻涛。有趣的是抹缕，ADARDD（E488Q）和所有REPAIRv1脫靶編輯之間的脫靶編輯事件高度重疊澈蟆，支持REPAIR脫靶編輯由dCas13b獨(dú)立ADARDD編輯事件驅(qū)動(dòng)的假設(shè)（圖S8D）。

接下來(lái)卓研，研究者試圖比較先前描述的兩種RNA引導(dǎo)的ADAR系統(tǒng)（圖S9A）趴俘。第一種利用ADAR2DD與小病毒蛋白λN（?N）的融合，λN與BoxB-?RNA發(fā)夾結(jié)合（24）奏赘。帶有雙BoxB-?發(fā)夾的引導(dǎo)RNA引導(dǎo)ADAR2DD編輯引導(dǎo)RNA中編碼的位點(diǎn)（25）寥闪。第二種設(shè)計(jì)利用全長(zhǎng)ADAR2（ADAR2）和帶有發(fā)夾的引導(dǎo)RNA，ADAR2的雙鏈RNA結(jié)合域（dsRBD）識(shí)別該發(fā)夾（23磨淌，26）疲憋。研究者分析了這兩個(gè)系統(tǒng)與REPAIRv1相比的編輯效率，發(fā)現(xiàn)BoxB-ADAR2和全長(zhǎng)ADAR2系統(tǒng)分別顯示了50%和34.5%的編輯率梁只，而REPAIRv1實(shí)現(xiàn)了89%的編輯率（圖S9B–E）缚柳。此外，BoxB和全長(zhǎng)ADAR2系統(tǒng)分別在靶向引導(dǎo)條件下創(chuàng)建了1814個(gè)和66個(gè)觀察到的偏離目標(biāo)敛纲，而在REPAIRv1靶向引導(dǎo)情況下創(chuàng)建了2111個(gè)偏離目標(biāo)喂击。值得注意的是，兩個(gè)基于ADAR2DD的系統(tǒng)（REPAIRv1和BoxB）的所有條件都顯示出其偏離目標(biāo)的高百分比重疊淤翔，而全長(zhǎng)ADAR2系統(tǒng)具有一組明顯不同的偏離目標(biāo)（圖S9F）翰绊。靶向和非靶向條件之間以及REPAIRv1和BoxB條件之間的偏離目標(biāo)重疊表明ADAR2DD獨(dú)立于dCas13靶向驅(qū)動(dòng)偏離目標(biāo)（圖S9F）。

圖5 REPAIRv1的特異性

通過(guò)合理的蛋白質(zhì)工程提高修復(fù)的特異性

為了提高REPAIRv1的特異性旁壮，研究者采用了ADAR2DD（E488Q）的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向蛋白工程监嗜。由于非靶點(diǎn)的指南獨(dú)立性，研究者假設(shè)破壞ADAR2DD（E488Q）-RNA結(jié)合的穩(wěn)定性將選擇性地減少非靶點(diǎn)編輯抡谐，但由于ADAR2DD的dCas13b系鏈（E488Q）到靶位點(diǎn)的局部濃度增加裁奇，因此維持靶點(diǎn)編輯。研究者突變了ADAR2DD（E488Q）中的殘基麦撵，之前確定其與靶RNA的雙鏈區(qū)接觸（圖6A）（19）刽肠。為了評(píng)估效率和特異性溃肪，研究者使用靶向和非靶向指南測(cè)試了17個(gè)單突變體，假設(shè)在非靶向條件下背景熒光素酶恢復(fù)將指示更廣泛的脫靶活性音五。研究者發(fā)現(xiàn)惫撰，所選殘基處的突變對(duì)靶向和非靶向指南的熒光素酶活性有顯著影響（圖6A，B躺涝，圖S10A）厨钻。大多數(shù)突變體要么顯著提高了靶向?qū)蛭锏臒晒馑孛富钚裕丛黾恿税邢蚺c非靶向?qū)蚧钚缘谋嚷始崾龋芯空叻Q之為特異性得分（圖6A夯膀，B）。

研究者選擇了這些突變體的一個(gè)子集（圖6B）苍蔬，通過(guò)下一代測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組范圍的特異性分析诱建。正如預(yù)期的，從轉(zhuǎn)錄組范圍測(cè)序測(cè)量的非靶點(diǎn)與研究者的突變體特異性得分相關(guān)（圖S10B）银室。研究者發(fā)現(xiàn)涂佃，除ADAR2DD（E488Q/R455E）外，所有測(cè)序的REPAIRv1突變體都可以有效編輯報(bào)告轉(zhuǎn)錄本（圖6C）蜈敢，許多突變體顯示出非靶點(diǎn)數(shù)量的減少（圖6CC辜荠，圖S10C，S11）抓狭。研究者進(jìn)一步探索了各種特異性突變體的脫靶周圍基序伯病，發(fā)現(xiàn)REPAIRv1和大多數(shù)工程變體對(duì)其脫靶編輯表現(xiàn)出強(qiáng)烈的3'G偏好，與特征化的ADAR2基序一致（圖S12A）（28）否过。

研究者重點(diǎn)關(guān)注了突變體ADAR2DD（E488Q/T375G）午笛，因?yàn)樗谒膫€(gè)轉(zhuǎn)錄組廣泛靶點(diǎn)數(shù)量最少的突變體中具有最高的編輯百分比，并將其稱為REPAIRv2苗桂。與REPAIRv1相比药磺，REPAIRv2表現(xiàn)出更強(qiáng)的特異性，通過(guò)高覆蓋測(cè)序（125X覆蓋率煤伟，10ng DNA轉(zhuǎn)染）癌佩，轉(zhuǎn)錄組廣泛目標(biāo)從18385個(gè)減少到20個(gè)（圖6D）。在Cluc中靶向腺苷周圍的區(qū)域便锨，REPAIRv2也減少了脫靶編輯围辙，在測(cè)序痕跡中可見(jiàn)（圖6E）。在源自非目標(biāo)位點(diǎn)的圖案中放案，REPAIRv1表現(xiàn)出對(duì)3'G的強(qiáng)烈偏好姚建，但顯示出對(duì)所有圖案的目標(biāo)編輯（圖S12B）；相比之下吱殉，REPAIRv2僅編輯了最強(qiáng)的偏離目標(biāo)圖案（圖S12C）掸冤。REPAIRv1的轉(zhuǎn)錄本編輯分布嚴(yán)重扭曲厘托，高度編輯的基因有超過(guò)60個(gè)編輯（圖S13A），而REPAIRv2只多次編輯一個(gè)轉(zhuǎn)錄本（EEF1A1）（圖S13B）贩虾。REPAIRv1脫靶編輯被預(yù)測(cè)會(huì)導(dǎo)致多種變體催烘，包括1000個(gè)錯(cuò)義堿基改變（圖S13C）沥阱，93個(gè)與癌癥過(guò)程相關(guān)的基因事件（圖S13D）缎罢。相比之下，REPAIRv2只有6個(gè)預(yù)測(cè)的堿基變化（圖S10E）考杉，其中沒(méi)有一個(gè)在癌癥相關(guān)基因中（圖S13F）策精。對(duì)圍繞REPAIRv1或v2的脫靶編輯的序列的分析沒(méi)有揭示與指南序列的同源性，表明脫靶可能是dCas13b獨(dú)立的（圖S14）崇棠，與REPAIRv1和ADAR脫氨酶結(jié)構(gòu)域之間的脫靶高度重疊一致（圖S8D）咽袜。為了直接將REPAIRv2與其他可編程ADAR系統(tǒng)進(jìn)行比較，研究者在兩種不同劑量的ADAR載體下對(duì)所有系統(tǒng)重復(fù)了研究者的Cluc靶向?qū)嶒?yàn)枕稀，發(fā)現(xiàn)REPAIRv2具有與BoxB和ADAR2相當(dāng)?shù)陌邢蚓庉嬔玻趦煞N劑量下，脫靶編輯事件顯著減少（圖S15）萎坷。與兩種劑量的REPAIRv1相比凹联，REPAIRv2具有更強(qiáng)的特異性（圖S15B），這一發(fā)現(xiàn)也擴(kuò)展到針對(duì)PPIB上不同位點(diǎn)的兩種指南（圖S16A-D）哆档。還值得注意的是蔽挠，一般而言，較低劑量條件（10ng）的偏離目標(biāo)比較高劑量條件（150ng）的少（圖S5）瓜浸。

為了以更高的靈敏度評(píng)估編輯特異性澳淑，研究者在顯著更高的測(cè)序深度（轉(zhuǎn)錄組的125X覆蓋率）對(duì)REPAIRv1和v2的低劑量條件（10ng轉(zhuǎn)染DNA）進(jìn)行了測(cè)序。在與檢測(cè)到更罕見(jiàn)的脫靶事件相對(duì)應(yīng)的更高測(cè)序深度處發(fā)現(xiàn)了更多的脫靶（圖S17）插佛。此外杠巡，研究者推測(cè)，不同的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)也可能改變脫靶事件的數(shù)量雇寇。因此氢拥，研究者測(cè)試了骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中的REPAIRv2活性，分別觀察了靶向和非靶向?qū)虻?個(gè)和7個(gè)非靶向（圖S18）谢床。

研究者將REPAIRv2靶向內(nèi)源性基因兄一，以測(cè)試特異性增強(qiáng)突變是否減少了靶轉(zhuǎn)錄物中的附近編輯，同時(shí)保持了高效的靶編輯识腿。對(duì)于靶向KRAS或PPIB的指南出革，研究者發(fā)現(xiàn)，與REPAIRv1不同渡讼，REPAIRv2沒(méi)有可檢測(cè)到的脫靶編輯骂束，并且可以有效地編輯目標(biāo)腺苷耳璧，效率為27.1%（KRAS）或13%（PPIB）（圖6F）。這種特異性擴(kuò)展到其他靶位點(diǎn)展箱，包括在REPAIRv1的非靶向條件下表現(xiàn)出高水平背景的區(qū)域旨枯，例如其他KRAS或PPIB靶位點(diǎn)（圖S19）』斐郏總的來(lái)說(shuō)攀隔，REPAIRv2消除了編輯腺苷周圍雙鏈區(qū)的脫靶，并顯示出顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄組特異性栖榨。

圖6 誘變ADAR2提高REPAIRv1特異性