作者萝衩，追風(fēng)少年i

馬上中秋了回挽，祝大家節(jié)日快樂(lè)，我們這一篇進(jìn)行分析合集猩谊，回顧一下空間轉(zhuǎn)錄組的分析重點(diǎn),包括8個(gè)部分

• CellphoneDB V3.0 助力空間轉(zhuǎn)錄組生態(tài)位通訊分析
• 10X空間轉(zhuǎn)錄組千劈，空間位置帶給了我們什么信息？
• 10X單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)分析之表征細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型
• 全球首篇FFPE空間轉(zhuǎn)錄組研究文章揭示腎細(xì)胞癌中三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)抗腫瘤機(jī)制
• 空間轉(zhuǎn)錄組之免疫組庫(kù)分析
• 單細(xì)胞空間聯(lián)合分析方法論
• 時(shí)空通訊分析導(dǎo)論
• 空間轉(zhuǎn)錄組聚類(lèi)分析與生態(tài)位

CellphoneDB V3.0 助力空間轉(zhuǎn)錄組生態(tài)位通訊分析

2022年也馬上要過(guò)去牌捷，空間轉(zhuǎn)錄組又陪伴我們走過(guò)了一年墙牌，這項(xiàng)2020年的年度技術(shù)涡驮，在生物組織研究的各個(gè)領(lǐng)域都有了廣泛的運(yùn)用，也提供了很多生物學(xué)研究的新角度喜滨，其實(shí)包括空間細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)捉捅、空間軌跡、空間共表達(dá)模塊等等等等虽风，其中棒口，無(wú)論對(duì)于單細(xì)胞還是空間轉(zhuǎn)錄組，細(xì)胞之間的相互作用是繞不開(kāi)的話題辜膝，組織是一個(gè)統(tǒng)一體无牵，細(xì)胞之間不可能割裂的存在，而是存在廣泛的相互交流厂抖，來(lái)維持組織的正常生物學(xué)功能茎毁。

單細(xì)胞研究細(xì)胞通訊已經(jīng)有了廣泛的案例，但是在缺少空間位置的情況下忱辅，尤其在多樣本整合分析的時(shí)候七蜘，忽略了細(xì)胞之間距離遠(yuǎn)近和個(gè)體的影響，與此同時(shí)耕蝉，越來(lái)越多的研究表明崔梗，細(xì)胞之間的相互作用很可能僅限于最近鄰，在空間轉(zhuǎn)錄組的分析上垒在，也明顯發(fā)現(xiàn)蒜魄，每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型都顯示一個(gè)相對(duì)恒定的生態(tài)位特征。

基于此场躯，很多研究人員開(kāi)發(fā)了針對(duì)空間鄰域通訊分析的分析軟件谈为，時(shí)下引用最多的單細(xì)胞通訊分析軟件---CellphoneDB^[1]，也已升級(jí)到3.0版本踢关，專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)了針對(duì)空間生態(tài)的分析模塊伞鲫，我們來(lái)一探究竟。

CellphoneDB（V3.0）的創(chuàng)新點(diǎn)

1签舞、合并空間信息 秕脓，CellPhoneDB 現(xiàn)在允許通過(guò)微環(huán)境文件合并細(xì)胞的空間信息。 這是一個(gè)兩列文件儒搭，指示哪種細(xì)胞類(lèi)型在哪個(gè)空間微環(huán)境中（參見(jiàn)示例見(jiàn)下表）吠架。 CellphoneDB 將使用此信息來(lái)定義可能的交互細(xì)胞對(duì)（即在微環(huán)境中共享/共存的clusters）。 可以使用 cell2location^[2] 定義具有先驗(yàn)知識(shí)搂鲫、成像或 Visium 分析的微環(huán)境傍药。

表1 空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞微環(huán)境

2、添加了新的分析方法 使用差異表達(dá)基因 (DEG) 而不是 random shuffling（cellphonedb 方法 degs_analysis）。 這種方法將選擇所有基因都由高于閾值的一小部分細(xì)胞表達(dá)并且至少一個(gè)基因是 DEG 的相互作用拐辽。 可以使用自定義的工具識(shí)別 DEG拣挪，并通過(guò)文本文件將信息提供給 CellphoneDB。 第一列應(yīng)該是細(xì)胞類(lèi)型/cluster俱诸，第二列應(yīng)該是相關(guān)的基因 id菠劝。 其余列將被忽略（參見(jiàn)示例見(jiàn)下表）。

表二 差異基因分析結(jié)果

3乙埃、Database update WNT pathway has been further curated. CellPhoneDB 考慮了大多數(shù)配體和受體的多聚體組成闸英，這與 WNT 信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜調(diào)控高度相關(guān)

圖1 CellphoneDB擴(kuò)展了數(shù)據(jù)庫(kù)

CellphoneDB（V3.0）的運(yùn)用案例

目前CellphoneDB（V3.0）已經(jīng)得到了很好的運(yùn)用，我們參考最新發(fā)表的文章Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro^[3]介袜，2021年12月份發(fā)表于Nature Genetics甫何，IF 38.330，文中為了研究細(xì)胞在管腔和腺體間的相互作用遇伞，首先運(yùn)用10X 空間轉(zhuǎn)錄組對(duì)組織區(qū)域進(jìn)行分層聚類(lèi)辙喂，發(fā)現(xiàn)WNT 和 NOTCH 信號(hào)通路的特征存在于不同的子宮內(nèi)膜區(qū)域。參與 WNT 通路的基因 FOXJ1 和 LGR5 在管腔表面高度表達(dá)鸠珠，而 NOTCH2在功能層的腺體中顯著富集巍耗。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，使用 smFISH 探針對(duì)目標(biāo)信號(hào)基因進(jìn)行染色渐排，從而量化信號(hào)基因的表達(dá)與管腔的距離炬太，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與腺體相比驯耻，NOTCH2 表達(dá)在遠(yuǎn)離管腔的腺體中增加亲族，而 WNT7A 在管腔上皮中的表達(dá)高于腺體。相比之下可缚，非經(jīng)典 WNT 分子 WNT5A 主要在腺體周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞中表達(dá)霎迫。這些發(fā)現(xiàn)表明，經(jīng)典的 WNT信號(hào)在腺體微環(huán)境中被抑制帘靡。

圖2 信號(hào)通路的空間表達(dá)特征

其次運(yùn)用cell2location^[2] 的方法來(lái)識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型的生態(tài)位知给，定義了三個(gè)以上皮細(xì)胞為中心的子宮內(nèi)膜微環(huán)境：

(1) lumenal—preciliated, ciliated and SOX9⁺LGR5⁺ epithelium (proliferative phase) and ciliated and lumenal (secretory phase)；

(2) functional—SOX9⁺ proliferative epithelium, immune and eS (proliferative phase) and immune, glandular and dS (secretory phase)描姚；

(3) basal—SOX9⁺LGR5^? and fibroblasts C7

圖3 單細(xì)胞空間聯(lián)合分析識(shí)別空間生態(tài)位

然后結(jié)合空間位置的微環(huán)境來(lái)分析細(xì)胞類(lèi)型生態(tài)位的相互交流涩赢，發(fā)現(xiàn)顯著的上皮-基質(zhì)相互作用，其中NOTCH信號(hào)主要由上皮細(xì)胞介導(dǎo)轩勘，但是高表達(dá)JAG1的上皮細(xì)胞卻經(jīng)常與表達(dá)HEY1但低水平表達(dá)JAG1的細(xì)胞相鄰谒主，表明嚴(yán)格的空間臨近的細(xì)胞通訊；與此同時(shí)在分泌細(xì)胞譜系中WNT信號(hào)通路受到周?chē)?xì)胞的嚴(yán)格抑制赃阀，說(shuō)明在細(xì)胞在空間位置上信號(hào)傳導(dǎo)受到生態(tài)位的嚴(yán)格調(diào)控。

圖4 空間通訊信號(hào)激活與抑制

細(xì)胞通訊分析的單細(xì)胞空間聯(lián)合

其實(shí)對(duì)于生物學(xué)組織統(tǒng)一體的認(rèn)知，主要體現(xiàn)在細(xì)胞與細(xì)胞類(lèi)型時(shí)間上和空間上的嚴(yán)格調(diào)控榛斯，細(xì)胞類(lèi)型不會(huì)是隨機(jī)出現(xiàn)在任何位置观游，而是在恒定的時(shí)間，恒定的地點(diǎn)發(fā)揮其獨(dú)特的作用驮俗，且受到周?chē)h(huán)境的影響懂缕。研究中也發(fā)現(xiàn)每種細(xì)胞類(lèi)型都會(huì)匹配一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)位，生態(tài)位對(duì)細(xì)胞之間交流的嚴(yán)格調(diào)控才是體現(xiàn)組織真正微環(huán)境的關(guān)鍵所在王凑，而我們要實(shí)現(xiàn)對(duì)組織內(nèi)部微環(huán)境的真正認(rèn)知搪柑，不僅僅需要單細(xì)胞數(shù)據(jù)精確地告訴我們有哪些細(xì)胞類(lèi)型，更需要空間轉(zhuǎn)錄組分析出細(xì)胞類(lèi)型周?chē)鄬?duì)恒定的微環(huán)境索烹，由此強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合工碾，才可對(duì)認(rèn)知組織的有序性、疾病對(duì)組織的影響以及對(duì)臨床運(yùn)用方面提供有價(jià)值的參考百姓。

[1]Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A. & Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell–cell communication from combined expression of multi-subunit ligand–receptor complexes. Nat. Protoc. 15, 1484–1506 (2020).
[2]Kleshchevnikov, V. et al. Comprehensive mapping of tissue cell architecture via integrated single cell and spatial transcriptomics. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.11.15.378125 (2020).
[3]Luz Garcia-Alonso. et al.Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro.nature genetics.53, pages 1698–1711 (2021).

10X空間轉(zhuǎn)錄組渊额，空間位置帶給了我們什么信息？

2020年被Nature Methods評(píng)為年度技術(shù)的空間轉(zhuǎn)錄組垒拢，時(shí)至今日旬迹，陪伴我們科研人員已經(jīng)2年了，在這期間求类，涌現(xiàn)了很多別具一格的分析角度奔垦，不斷刷新著我們對(duì)組織空間理解。對(duì)于生物學(xué)組織而言尸疆，細(xì)胞空間位置分布的重要性不言而喻椿猎，對(duì)于細(xì)胞空間分布的研究，也是我們研究發(fā)育仓技、疾病等等生物學(xué)問(wèn)題最為重要的課題之一鸵贬，其中最為關(guān)鍵的是，對(duì)于空間位置信息的認(rèn)知脖捻，如何深入挖掘空間上的生物學(xué)內(nèi)容阔逼，逐漸成為我們倚重的分析點(diǎn)。

目前對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組位置信息的分析嚴(yán)重不足地沮，典型如Seurat^[1],更多的基于每個(gè)spot的基因表達(dá)信息進(jìn)行降維聚類(lèi)等下游分析嗜浮，幾乎完全缺乏對(duì)空間信息的處理；也包括一些尋找空間高變基因的軟件如SpatialDE^[2]摩疑、SPARK^[3]等危融，也僅僅是簡(jiǎn)單利用空間位置尋找基因在空間上的區(qū)域變化，完全無(wú)法滿(mǎn)足科研人員對(duì)于組織有序性和不同細(xì)胞類(lèi)型在空間位置上“協(xié)作”的研究;尤其對(duì)于細(xì)胞在空間上聚集的原因與作用雷袋，細(xì)胞在不同層面的“等級(jí)”變化等等吉殃，都在不斷強(qiáng)調(diào)對(duì)空間位置信息的挖掘。前人栽樹(shù)，后人乘涼蛋勺，就讓我們帶著對(duì)空間位置信息的分析角度瓦灶，目睹其帶給我們的生物學(xué)認(rèn)知。

分析點(diǎn)1抱完、空間位置上的細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”

什么是細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”贼陶？細(xì)胞在空間位置上不是隨機(jī)出現(xiàn)的，細(xì)胞在空間上的定位受到了周?chē)h(huán)境以及自身狀態(tài)的影響巧娱，而這種影響的結(jié)果碉怔，就是每種細(xì)胞類(lèi)型在空間上形成了具有區(qū)域偏好性的細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”，在文章Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin^[4]中,為了系統(tǒng)的確定白色脂肪組織（WAT）的細(xì)胞區(qū)域“網(wǎng)絡(luò)”,計(jì)算了每種細(xì)胞類(lèi)別中的空間位置彼此相鄰的傾向禁添，這里我們稱(chēng)之為同型細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”撮胧。文章的分析結(jié)果表明，所有免疫細(xì)胞上荡、脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞和血管細(xì)胞以及成熟脂肪細(xì)胞的同型細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”中都表現(xiàn)出很大的跨度趴樱，一些細(xì)胞類(lèi)型幾乎橫跨整合組織區(qū)域，如圖：

圖1 同型細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)

同型細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”是為了確定單一細(xì)胞類(lèi)型在空間上的分布特點(diǎn)酪捡，但為了確定不同細(xì)胞類(lèi)別之間的空間關(guān)系叁征，作者利用軟件STUtility來(lái)執(zhí)行成對(duì)的異型鄰域分析，我們稱(chēng)之為異型細(xì)胞“網(wǎng)絡(luò)”逛薇，用來(lái)衡量不同細(xì)胞類(lèi)型之間的空間臨近關(guān)系捺疼。如圖：

圖2 異型細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)

作者的研究發(fā)現(xiàn)，代表較大血管結(jié)構(gòu)的Spot在血管樣組織學(xué)特征上彼此靠近永罚；并且發(fā)現(xiàn)特定祖細(xì)胞位于巨噬細(xì)胞附近并形成用于組織修復(fù)和重塑的脂肪生成生態(tài)位啤呼。

分析點(diǎn)2、探索細(xì)胞“單元”