hello，大家好租漂，霧霾天就適合寫寫東西阶女，放松一下，今天我們來分享一下運用10X空間轉(zhuǎn)錄組識別免疫細胞生態(tài)位的內(nèi)容哩治，關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組識別生態(tài)位的內(nèi)容秃踩，我也分享了很多了，歡迎大家多多交流锚扎，今天分享的文章在A spatial multi-omics atlas of the human lung reveals a novel immune cell survival niche,10X空間轉(zhuǎn)錄組運用的文章吞瞪，值得一讀和借鑒其中的分析方法。

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文章值得注意的地方

• 單細胞和單核細胞分析出來的細胞類型比例還是有差異的
• 單細胞空間聯(lián)合和單核細胞空間聯(lián)合的結(jié)果差異
• 空間臨近通訊
• 目標細胞生態(tài)位及細胞類型組成

Summary

單細胞 RNA 測序 (scRNAseq) 已定義了人肺和氣道的多種不同細胞類型驾孔。在這里芍秆，研究提出了一個多組學空間肺圖譜來定義新的細胞類型，將其映射回宏觀和微觀解剖組織環(huán)境翠勉，以定義功能性組織微環(huán)境妖啥。首先，從肺和氣道的 5 個不同位置生成了單細胞和核 RNA 測序对碌、VDJ 測序和 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)集荆虱。其次，定義了額外的細胞類型/狀態(tài)朽们，并在空間上繪制了新的和已知的human呼吸道細胞類型怀读，例如肺軟骨細胞、粘膜下腺 (SMG) 導管細胞骑脱、不同的周細胞和平滑肌亞型菜枷、免疫招募成纖維細胞、支氣管周圍和軟骨膜成纖維細胞叁丧、周圍神經(jīng)相關(guān)成纖維細胞和Schwann細胞啤誊。最后岳瞭，在 SMG 定義了 IgA 分泌漿細胞的survival niche，包括新定義的上皮 SMG-Duct 細胞以及 B 和 T 譜系免疫細胞蚊锹。使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行細胞間相互作用分析瞳筏，提出了一個建立和支持這一生態(tài)位的信號通路∧道ィ總體而言姚炕，研究提供了具有多種新型細胞類型的轉(zhuǎn)錄和空間肺圖譜，可用于研究特定的組織微環(huán)境迁杨，例如新定義的腺相關(guān)淋巴生態(tài)位 (GALN)钻心。

Introduction

Lung disease is the third-largest cause of mortality worldwide，因此必須更好地了解定義肺功能的細胞類型铅协。 肺的組織學定義確定了大約 45 種不同的細胞類型，從特征明確的肺上皮細胞到罕見的神經(jīng)內(nèi)分泌和簇狀細胞摊沉，并因氣管狐史、小氣道和肺泡的位置而異。 除了呼吸功能外说墨，肺還有重要的屏障功能骏全。 雖然腸道和鼻咽等其他黏膜屏障組織通過明確定義的黏膜相關(guān)淋巴組織 (MALT) 協(xié)調(diào)適應性免疫，但在健康人肺中尚未報道此類次級淋巴結(jié)構(gòu)尼斧。
The LungMAP and Human Lung Cell Atlas consortia利用單細胞和單核 RNA 測序方面的最新技術(shù)進步姜贡，生成了許多表征小鼠和human肺細胞類型的圖譜。 除了先前已知的分類外棺棵，這項工作還確定了新的細胞狀態(tài)和類型楼咳，例如肺離子細胞、氘代體細胞和組織遷移性 T 輔助細胞群烛恤。 呼吸系統(tǒng)疾病母怜，如哮喘、肺纖維化缚柏、慢性鼻竇炎苹熏、囊性纖維化和吸煙的影響，都在單細胞轉(zhuǎn)錄組水平上進行了研究币喧。
然而轨域，細胞類型回到組織環(huán)境的unbiased spatial mapping仍然在很大程度上缺乏，酶解程序可能導致不具有代表性的細胞類型retrieval杀餐。為了克服這些限制干发，研究將單細胞和單核 RNA 測序與 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學 (ST) 相結(jié)合，創(chuàng)建了一個包含 129,340 個細胞怜浅、63,768 個細胞核和 16 個來自human氣管铐然、支氣管和實質(zhì)組織切片的肺細胞圖譜蔬崩。描述了 77 種細胞類型和狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄特征，首次包括human氣道軟骨細胞搀暑、兩種Schwann細胞沥阳、神經(jīng)相關(guān)細胞、粘膜下腺 (SMG) 導管細胞以及多個血管周圍自点、成纖維細胞和巨噬細胞subset的轉(zhuǎn)錄特征.深層組織分析與空間基因表達分析相結(jié)合桐罕，使我們能夠在氣道的 SMG 處識別出 IgA 分泌漿細胞的新免疫生態(tài)位。我們預測內(nèi)皮細胞桂敛、上皮細胞功炮、基質(zhì)細胞和免疫細胞之間的細胞間相互作用，這些相互作用有助于建立這個生態(tài)位术唬。 IgA 分泌在預防呼吸道感染中起著至關(guān)重要的作用薪伏，因此研究結(jié)果有助于更深入地了解包括 COVID-19 在內(nèi)的各種呼吸道傳染病.

Results

A multi-omic transcriptional atlas of the human lung and airway with spatial resolution

為了生成human肺和氣道中細胞類型的綜合表征，將單細胞和細胞核 RNAseq（scRNAseq粗仓、snRNAseq）嫁怀、VDJ 測序和空間轉(zhuǎn)錄組學應用于深層組織樣本。 從氣管借浊、第 1 或第 2 層氣道 (Bronchi 2-3)塘淑、第 3 至第 4 層氣道 (Bronchi 4) 中的支氣管、左上方的實質(zhì)中收集來自健康供體的組織塊 (1-2 cm3) 葉 (UpperPar) 和左下葉 (LowerPar) 捕獲深層結(jié)構(gòu)蚂斤，如氣道中的軟骨存捺、肌肉和粘膜下腺。

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• 注： Multi-omics spatial lung atlas experimental design included fresh and frozen sampling from 5 locations for single-cell (sc) RNA sequencing (RNAseq), sc VDJ-sequencing, single-nuclei (sn) RNAseq and Visium Spatial Transcriptomics (ST). Five donors (D) from the frozen samples were pooled into five reactions, each containing different locations (Loc) from donors

總共 193,108 個good quality transcriptomes被注釋為轉(zhuǎn)錄不同的廣泛細胞類型：上皮細胞（分泌細胞曙蒸、基底細胞捌治、肺泡 1 和 2 型 - AT1 和 AT2 - 肺細胞、纖毛細胞和 SMG 細胞）逸爵、免疫細胞（淋巴具滴、髓細胞、B 細胞师倔、根據(jù)廣泛接受的標記基因构韵，血漿、肥大細胞）趋艘、紅細胞疲恢、內(nèi)皮細胞（血管-VE、淋巴-LE）和基質(zhì)細胞（平滑肌瓷胧、成纖維細胞显拳、間皮細胞和軟骨細胞）。我們將懸浮細胞和細胞核的分析與 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學 (ST) 分析相結(jié)合搓萧，將鑒定的細胞類型映射回來自 5 個位置的 16 個組織切片的組織結(jié)構(gòu)杂数，這些組織切片被手動注釋到 13 個區(qū)域宛畦。正如預期的那樣，使用 Cell2location 算法將纖毛上皮細胞映射到被基底細胞包圍的氣道內(nèi)腔揍移，將 AT1 和 AT2 映射到肺實質(zhì)次和。為了檢查不同協(xié)議和采樣位置的好處，使用泊松線性混合模型來評估這些變量對細胞類型組成的相對影響那伐。正如預期的那樣踏施，不同的酶處理豐富了特定的細胞類型組，但對基因表達的影響很小罕邀，不到總方差的 1%畅形。

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為了證明圖譜的深度和新穎性，我們首次在human肺部（ACAN诉探、CHAD日熬、COL9A3、HAPLN1 和 CYTL1）中轉(zhuǎn)錄定義了軟骨細胞阵具，并使用 Visium ST 將這些細胞映射到軟骨碍遍。 軟骨細胞主要是使用氣管的單核測序釋放的，這證明了分析的多組學阳液、多位置人肺圖譜的實用性。

總體而言揣炕，生成了一個大型 scRNAseq 和 snRNAseq 數(shù)據(jù)集帘皿，具有不同細胞譜系的廣泛代表性和匹配的空間基因表達數(shù)據(jù)，允許進一步探索細胞異質(zhì)性和可能的細胞間相互作用畸陡，以更好地了解肺功能鹰溜。

Identification of rare fibroblasts with immune recruiting properties

肺和氣道成纖維細胞的連續(xù)聚類鑒定了 11 種具有不同標記基因的細胞類型。這里注釋了先前描述的肌成纖維細胞丁恭、間皮曹动、外膜和肺泡成纖維細胞，以及多種新的和研究較少的細胞類型牲览，這些細胞類型無法用現(xiàn)有的注釋進行預測墓陈。雖然大多數(shù)細胞類型是從所有位置和protocol中分離出來的，但細胞類型比例存在明顯差異第献。正如預期的那樣贡必，外膜成纖維細胞 (Fibro-adv) 在氣道樣本中富集，而肺泡成纖維細胞 (Fibro-alv) 被耗盡庸毫。We further observed a rare cell type recovered only from the single cells, but not from single nuclei. 這種罕見的類型表達趨化因子 CCL19 和 CCL21仔拟，在負責淋巴結(jié)中 T 細胞定位的成纖維細胞網(wǎng)狀細胞和 GREM1、CXCL13 和 FDCSP（一種負責 B 細胞定位的濾泡樹突細胞 (FDC) 標記物）中也高度表達飒赃。這些細胞用 Visium ST 和 smFISH 方法映射到支氣管上的免疫細胞浸潤區(qū)域利花，因此被注釋為免疫募集成纖維細胞 (IR-纖維)科侈。僅在一部分供體和切片中發(fā)現(xiàn)免疫浸潤，但與有和無吸煙史的供體的預期頻率一致炒事。 IR 纖維顯示來自二級和三級淋巴結(jié)構(gòu)的成纖維細胞的一些特征臀栈，發(fā)現(xiàn)進一步支持了這種相似性，即來自human腸道 Peyer's Patches 的germinal center成纖維細胞類型的基因特征也映射到免疫浸潤區(qū)域在肺 Visium ST 切片上羡洛」夷裕總之，研究描述了一個 IR 纖維群欲侮，它可能在健康支氣管中的免疫細胞募集中發(fā)揮作用崭闲。

Perichondrial and peribronchial fibroblasts reveal disease associations.

接下來檢查了兩種富含氣管的成纖維細胞群：支氣管周圍（PB-纖維）和軟骨周圍（PC-纖維）成纖維細胞。 我們首次提供具有 COL15A1 和 ENTPD1 標記的 PB 纖維的human轉(zhuǎn)錄組以及氣道上皮周圍的定位威蕉。 功能 GWAS 分析量化了細胞類型特異性基因表達和疾病相關(guān) SNP 之間的系統(tǒng)關(guān)聯(lián)刁俭，證明 PB 纖維與慢性阻塞性肺病 (COPD) 相關(guān)。 PB-fibro 還表達 LGR5韧涨，正如在小鼠中報道的那樣牍戚，這表明在human中具有類似的間充質(zhì)干細胞功能的潛力。 WNT-5A 的 COPD 相關(guān)增加下調(diào) Lgr5虑粥，這表明 PB 纖維可以在治療上靶向抑制 COPD 的再生衰竭如孝，特別是在氣道中.
第二種富含氣道的細胞類型 PC-纖維僅在單核數(shù)據(jù)中檢測到，可能是由于軟骨分離困難娩贷。 細胞類型位于 Visium ST 中軟骨內(nèi)的軟骨細胞周圍第晰，可以通過human蛋白質(zhì)圖譜中標記基因 COL12A1 的表達來識別。 在 PC 纖維的標記基因中彬祖，我們檢測到骨發(fā)育基因 LGR4 和 LGR6茁瘦。 PC-fibro 表達標準的成纖維細胞標志物，在表達與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因方面是獨一無二的储笑，將這些細胞置于從外膜成纖維細胞到軟骨細胞的軌跡中甜熔。 最后，PC-纖維標志物富含導致human骨骼異常的基因突倍，包括在導致骨骼畸形的罕見疾病中發(fā)生突變的 FLNB 和 FGFR2腔稀。 總之，已經(jīng)確定了健康人氣道軟骨周圍的軟骨膜成纖維細胞赘方。

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• 注：High resolution of lung and airway fibroblasts and their spatial location.(a) Sequential clustering reveals 11 fibroblast populations in airways and lungs on UMAP. (b) Sample collection location and processing method affect recovered cell type proportions.Cell type composition analysis with fibroblast compartment, including location, material,dissociation protocol and donor in the model. (c) Markers of immune recruiting fibroblast population (IR-fibro) overlap with T reticular and Follicular Dendritic cell markers. (d) Immune recruiting fibroblast co-localise with immune infiltrate region in the airways with Cell2location anaysis. (e) Peribronchial fibroblasts (PB-fibro) co-localise around small airway. (f) Peribronchial fibroblasts are associated with COPD with fGWAS analysis. (g) Perichondrial fibroblasts (PC-fibro) localise around the cartilage regions in the airway. (h) Scwhann cells and nerve-associated fibroblasts (NAF) co-localise with peripheral nerve bundles via smFISH method. (i) Nerve-associated cell types markers have distinct locations in the airway nerve bundles. (j) Schematic representation of the described nerve-associated populations in the peripheral nerves of the airway.

Resolution of four distinct cell types in the peripheral nerves from the airway

最后烧颖，在成纖維細胞室中，確定了氣道周圍神經(jīng)內(nèi)的四個罕見細胞cluster：myelinating Schwann細胞（NFASC窄陡、NCMAP炕淮、MBP、PRX）跳夭、non-myelinating Schwann細胞（nmScwann）（NGFR涂圆、SCN7A们镜、CHD2、L1CAM润歉、 NCAM1)模狭、神經(jīng)內(nèi)膜神經(jīng)相關(guān)成纖維細胞 (NAF) (SOX9、OSR2) 和神經(jīng)外膜 NAF踩衩。這些細胞類型在周圍神經(jīng)中的定位通過組織中的大量 RNA-seq嚼鹉、Visum ST、蛋白質(zhì)染色和 smFISH 顯示驱富。具體來說锚赤，分析顯示了周圍神經(jīng)外膜 NAF 的表達，以及神經(jīng)內(nèi)膜 NAF 在human氣道樣本中神經(jīng)束內(nèi)的myelinating Schwann細胞的表達褐鸥。這進一步證實了髓鞘形成和非髓鞘形成myelinating Schwann細胞的身份线脚，分別在髓鞘形成和細胞粘附類別中具有標記基因集富集。該分析進一步揭示了 EVX1——一種脊髓發(fā)育中的同源盒基因——是髓鞘化myelinating Schwann細胞的潛在調(diào)節(jié)因子叫榕。其次浑侥，nmSchwann 表達了一些涉及Schwann細胞發(fā)育和維持 (SOX10) 和髓鞘形成 (ERBB3 和 LGI4) 的基因。最后晰绎，我們觀察到這些人群中罕見的外周神經(jīng)系統(tǒng) (PNS) 疾病基因的特異性表達寓落。因此，即使對于非常罕見的細胞類型荞下，我們的圖譜也能識別周圍神經(jīng)等結(jié)構(gòu)內(nèi)的顯微解剖位置并確定疾病關(guān)聯(lián)零如。這里描述的細胞類型存在于其他組織中；因此锄弱，這些數(shù)據(jù)可能會在肺之外產(chǎn)生影響。

Resolution of the vascular cell types in the systemic and pulmonary circulation

接下來專注于研究肺中的脈管系統(tǒng)祸憋，它包括為組織提供氧氣的體循環(huán)和發(fā)生氣體交換的肺循環(huán)会宪。在我們的數(shù)據(jù)集中，我們可以通過細胞類型的分布來區(qū)分肺循環(huán)和體循環(huán)的cluster蚯窥，其中肺細胞在實質(zhì)中富集掸鹅，全身細胞在氣管中富集。我們觀察到先前描述的靜脈（E-Ven-syst拦赠、E-Ven-pulm）和毛細血管（Cap巍沙、Car4-Aerocyte）內(nèi)皮細胞類型。此外荷鼠，我們現(xiàn)在區(qū)分動脈內(nèi)皮細胞類型（全身性 E-Art-syst 和肺 E-Art-pulm）句携，它們在 Visium ST 上具有明顯的定位，E-Art-syst 在氣管中富集允乐。平滑肌細胞包括非血管氣道平滑肌細胞 (ASM)矮嫉、肺血管周圍細胞類型（平滑肌 SM-pulm 和周細胞 Peri-pulm）和全身血管周圍細胞
（平滑肌 SM-Art-syst削咆、周細胞 Peri-syst 和靜脈血管周細胞 IR-Ven-Peri）。 ASM 的捕獲主要是通過單核數(shù)據(jù)實現(xiàn)的蠢笋，這些數(shù)據(jù)允許檢測跨組織的非血管平滑肌細胞類型的可靠標記基因.
此外拨齐，氣道中發(fā)現(xiàn)了另一種血管周圍細胞類型，表達 ABCC 和 ICAM1昨寞，但不表達 CSPG4——類似于毛細血管后靜脈血管周圍細胞瞻惋，在外周淋巴結(jié)中的免疫細胞歸巢中起作用。 這種細胞類型表達已知的白細胞募集趨化因子援岩，并與 Visium ST 支氣管切片和 smFISH 顯微鏡中的靜脈血管共定位歼狼。 因此，這些細胞被注釋為免疫募集靜脈血管周圍細胞 (IR-Ven-Peri)窄俏。 靜脈內(nèi)皮和 IR-Ven-Peri 中潛在的淋巴細胞募集能力表明在氣道靜脈中淋巴細胞外滲中的作用蹂匹，類似于外周淋巴結(jié)中的毛細血管后小靜脈。
總之凹蜈，我們區(qū)分了體循環(huán)和肺循環(huán)的細胞限寞，并描述了一種新的免疫募集毛細血管后靜脈周細胞 (IR-Ven-Peri)。 我們?yōu)樗羞@些群體提供標記基因仰坦，將這些細胞映射回組織環(huán)境履植，從而進一步確定體循環(huán)和肺循環(huán)中內(nèi)皮細胞和血管周圍細胞之間的關(guān)系

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• 注：Cell types of the systemic and pulmonary circulation. (a) UMAP visualisation of scRNA-seq data from the vascular endothelia and smooth muscle compartments. Color of dots shows cell type or location. Color of text reflects novelty. (b) E-Art-syst co-localises with arterial vessel and SM-Art-syst in the airway. (c) Marker genes of the smooth muscle compartment. (d) Enrichment of cell types shows preferential localisation to the airways versus parenchyma and cells versus nuclei. (e) IR-Ven-peri expresses immune recruiting chemokines and cell-cell adhesion molecules. (f) E-Ven-sys and IR-Ven-Peri co-localise at a venous vessel in the airway. (g) IR-Ven-Peri markers localise adjacent to the venous vessel marker in the airway. (h) Resolution of transcriptionally defined vascular cells in the systemic and pulmonary circulations.

Identification of duct and myoepithelial cells of the human airway submucosal glands (SMG)

對上皮區(qū)室（不包括 AT1 和 AT2 細胞）的進一步分析確定了預期的纖毛細胞、杯狀細胞悄晃、基底細胞玫霎、上基底細胞、分裂基底細胞妈橄、棒狀細胞庶近、SMG 粘液和漿液細胞群以及罕見的氘核細胞、離子細胞和刷狀細胞以及神經(jīng)內(nèi)分泌細胞眷蚓。除此之外鼻种，我們在漿液細胞、粘液細胞和棒狀細胞/杯狀細胞之間發(fā)現(xiàn)了一個新的群體沙热，其標記基因與人食道中的 SMG 導管細胞重疊叉钥，并在氣管中優(yōu)先定位。因此篙贸，我們假設這些細胞是human呼吸道的柱狀非纖毛導管細胞投队，以前僅在單細胞水平的小鼠中表征。 ALDH1A3爵川、MIA 和 RARRES1 的 smFISH 染色驗證了 SMG 的定位敷鸦，并將這些細胞與漿液、粘液和其他上皮細胞區(qū)分開來。與 SMG 粘液和漿液細胞相比轧膘，單細胞和 Visium 數(shù)據(jù)的 Cell2location 整合還可以區(qū)分 SMG 導管細胞的不同位置钞螟，為鑒定新的不同細胞類型提供正交證據(jù)。此外谎碍，Velocyto 分析表明這些細胞位于朝向表面上皮細胞群的軌跡上鳞滨，支持在氣道表面再生中的潛在作用，正如在小鼠中所證明的那樣
從 snRNAseq 揭示了一個額外的群體蟆淀，表現(xiàn)出基底上皮和肌肉標記物拯啦，定位在腺體周圍，與肌上皮細胞特征一致熔任。 FHOD3褒链、上皮標志物 KRT14 和肌肉標志物 TAGLN 在相同細胞中的共定位證實了 smFISH 的肌上皮細胞特征。 有趣的是疑苔，小鼠肌上皮細胞也被證明可以再生表面氣道上皮甫匹。 這種細胞類型在human中沒有得到很好的描述，可能是由于難以將這種細胞類型與氣道分離惦费，這與從細胞核數(shù)據(jù)中exclusive recovery肌上皮細胞一致兵迅。 總的來說，研究為新的 SMG 種群提供了human轉(zhuǎn)錄組信息薪贫，并使用空間轉(zhuǎn)錄組學和 smFISH 繪制了 SMG 的成分及其空間位置恍箭。

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• 注： IgA plasma cells in human airways co-localise with submucosal glands (a) UMAP of single nuclei RNA-seq airway epithelial cells (excluding parenchyma AT1 and AT2 epithelial cells) with dashed line around SMG-Duct and myoepithelial cells and a dot plot for the SMG-Duct marker genes. (b) RNAscope staining of mucous, serous and duct cells with respective marker genes MUC5B, LPO and ALDH1A3/RRARES1 in human bronchus

Proportions and gene signatures of the airway epithelial cells

使用考慮了材料、供體和解離方案的統(tǒng)計模型瞧省，我們檢查了采樣的 5 個不同位置的氣道上皮細胞的比例扯夭，顯著性以局部真征率 (LTR) 給出。 正如預期的那樣鞍匾，棒狀細胞在薄壁組織中富集交洗，而 SMG 上皮細胞在氣管中富集。 雖然供體和方案對上皮細胞類型比例幾乎沒有影響橡淑，但細胞與細胞核的起始材料強烈影響細胞類型組成藕筋。 細胞核中 SMG 上皮細胞捕獲增加，而其他上皮細胞類型的捕獲通過解離成單個細胞更好地實現(xiàn)
利用我們的多位置數(shù)據(jù)梳码，我們比較了纖毛細胞的基因表達，纖毛細胞是五個位置中存在的最豐富的細胞類型之一伍掀。 我們僅使用 snRNAseq 數(shù)據(jù)避免了由于位置之間不同的環(huán)境 RNA 污染而產(chǎn)生的任何artefacts掰茶，其中樣本在 10X 測序反應的位置之間匯集。 使用線性混合模型蜜笤，我們在氣管纖毛細胞中檢測到 80 個與其他位置（LTSR>0.9）相比差異表達的基因濒蒋，其中許多基因在鼻咽癌中上調(diào)，包括 FBXL7、TSHZ2 和 RAET1E沪伙。 我們還檢查了 ACE2 表達瓮顽，一種 SARS-COV-2 進入基因，我們發(fā)現(xiàn)該基因在來自氣管的纖毛細胞中最高围橡，而在肺遠端區(qū)域較低暖混，ACE2 的表達可能與之前報道的 AT2 細胞更相關(guān)。

Altogether, we describe transcriptomes for two key cell types involved in the SMG structure in the human airways which also functions as an immunological niche which we describe below.

Immune cells in the lung and airways

Myeloid cells show previously undescribed heterogeneity

對于免疫區(qū)室翁授，我們確定了所有主要細胞群拣播，包括髓細胞、T&NK收擦、B 譜系贮配、肥大細胞和巨核細胞，對它們進行單獨分析以揭示以前未描述的異質(zhì)性塞赂，尤其是在髓細胞中泪勒。我們發(fā)現(xiàn)了所有主要的骨髓細胞類型（DC、單核細胞和巨噬細胞）宴猾，包括許多已知和新的subset圆存。先前確定的巨噬細胞subset包括血管內(nèi)巨噬細胞（表達 LYVE1 和 MAF）、Macro-AW-CX3CR1鳍置、Macro-CHIT1（CHIT1 表達在哮喘辽剧、COPD 和肺纖維化中起作用）和間質(zhì)巨噬細胞（宏間質(zhì)表達趨化因子 CXCL9、10 和 11） . 我們發(fā)現(xiàn)了一個表達單核細胞 CD14 和巨噬細胞標志物的新cluster税产，稱為宏中間體怕轿。在肺泡巨噬細胞中，出現(xiàn)了另外兩個cluster：分裂細胞 (Macro-alv-dividing) 和表達金屬硫蛋白的新細胞cluser (Macro-alv- MT) 包括 MT1G辟拷、MT1X 和 MT1F撞羽。金屬硫蛋白具有結(jié)合和代謝金屬離子、免疫和應激反應的作用衫冻，因此該群體可能具有應對空氣污染的功能诀紊。最終罕見的巨噬細胞新群體表達了包括 CXCL8 在內(nèi)的趨化因子, CCL4 和 CCL20 并被命名為 Macro-CCL。雖然之前在間質(zhì)巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了 CCL4 的表達隅俘，但 CXCL8 的表達nd CCL20 區(qū)分了這個新的subset邻奠。 CXCL8 表達的失調(diào)與多種肺部疾病有關(guān)，包括感染、哮喘、IPF 和 COPD捏鱼，并被確定為銀屑病皮膚中單獨巨噬細胞群的標志物。
Overall, we have identified multiple known and novel myeloid populations in the healthy human lungs and airways, many of them expressing specific sets of chemokines, orchestrating the complex lung immune homeostasis.

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• 注：UMAP plots of myeloid, T/NK and B cell lineage cells, colored by cell type.

Different subsets of T & NK cells in the lung and airways

T 淋巴細胞和自然殺傷 (NK) 細胞包括所有主要細胞類型（CD4贰镣、CD8呜象、粘膜相關(guān)不變 T (MAIT)、NK碑隆、NKT恭陡、先天淋巴細胞 (ILC)）及其subset。在 CD4 隔室中上煤，我們區(qū)分了初始/中央記憶 (CD4-naive/CM)休玩、效應記憶/效應 (CD4-EM/效應)、調(diào)節(jié)性 T 細胞 (Treg) 和組織駐留記憶 (CD4-TRM) 細胞楼入。在 CD8 細胞中哥捕，我們發(fā)現(xiàn)了 gamma-delta T 細胞 (γδT) TRMs (CD8-TRM)，如文獻中所知嘉熊，它在我們的空間數(shù)據(jù)中很好地定位于氣道上皮遥赚。此外，我們看到了兩個不同的 CD8+ cluster阐肤，類似于在表達 CX3CR1 和 GZMB (CD8-EM/EMRA) 以及 CRTAM 和 GZMK (CD8-TRM/EM) 的跨組織分析中在肺中發(fā)現(xiàn)的群體凫佛。 NK 子集包括具有標記物 ITGAD/CD11d、LAG3孕惜、KLRC3/NKG3E愧薛、KLRC2/NKG2C (NK-CD11d)、CD16+ (NK-CD16hi) 和 CD56+ NK 細胞（NK-CD56 ）的cluster衫画。 CD11d 陽性的 NK 細胞在小鼠和human感染中都具有激活或病毒反應毫炉，并且之前在human血液中也有發(fā)現(xiàn)。據(jù)我們所知削罩，這是第一次在健康人肺中描述該subset 瞄勾。

與骨髓細胞cluster相比，T 和 NK 細胞在細胞類型比例上顯示出驚人的供體間變異性弥激，這與適應性免疫區(qū)室中較高的個體間變異性一致进陡。 來源、材料和協(xié)議的位置解釋了任何細胞類型比例幾乎沒有變化微服，包括 B 細胞

我們還獲得了 TCR VDJ 測序數(shù)據(jù)趾疚，證實了 MAIT 細胞類型注釋（優(yōu)先使用 TRAJ33 和 TRAV1-2），并且與記憶和effector subsets以蕴，幼稚和 Treg 群體的克隆擴增較低糙麦。 最后，我們表明丛肮，正如預期的那樣喳资，個體之間沒有克隆共享，但在一個供體的肺的多個位置發(fā)現(xiàn)了擴增的克隆腾供。

Co-localisation of IgA plasma cells with the SMG

B 細胞包括初始 B 細胞和記憶 B 細胞，以及被進一步注釋為免疫球蛋白 (Ig) IgG 或 IgA 分泌漿細胞和漿母細胞的漿細胞，并且這種注釋得到了 VDJ-seq 數(shù)據(jù)通過 Scirpy BCR 同種型分析的支持伴鳖。 IgA 對粘膜免疫很重要节值，是氣道樣本中最常見的同種型，而在實質(zhì)中僅位居第三榜聂。 有趣的是搞疗，我們觀察到，在來自鼻腔和支氣管刷樣本的單細胞數(shù)據(jù)中须肆，與健康對照相比匿乃，COVID-19 患者中 IgA 漿細胞相對于 IgG 的比例有所增加。 IgA 與 IgG 漿細胞的區(qū)別標志物包括 CCR10 和 B 細胞成熟抗原 BCMA (TNFRSF17)豌汇，它們分別對漿細胞定位和存活很重要
使用 Visium ST幢炸，我們在氣管和支氣管切片的氣道 SMG 中觀察到 IgA B 漿細胞的定位，而不是 B 或 IgG 漿細胞拒贱。 所有 Visium 切片的解剖區(qū)域注釋證實了 IgA 漿細胞與導管宛徊、漿液和粘液 SMG 細胞的共定位，而 IgG 映射到免疫浸潤逻澳。 IgA 漿細胞與 SMG 的映射在human蛋白質(zhì)圖譜中得到證實闸天，該圖譜顯示支氣管和鼻咽的 SMG 區(qū)域中存在大量漿細胞 (MZB1+)，以及 1970 年代的一項研究顯示 IgA 血漿的定位 人氣道中的細胞 SMG
使用多重 IHC斜做，我們以單細胞分辨率顯示 SMG 中 IgA2 漿細胞的特定存在苞氮，而 IgG 陽性細胞僅存在于 SMG 外的氣道中，與 Visium ST 一致瓤逼。 我們還在 SMG 中檢測到 IgD+ 幼稚 B 細胞和 CD3+CD4+ T 輔助細胞笼吟，表明 IgA 漿細胞得到了一組細胞類型的支持，這些細胞類型可以協(xié)調(diào) B 細胞成熟抛姑，將 IgA 直接分泌到氣道粘液中赞厕。 我們假設這些不同的細胞類型共同構(gòu)成了一個免疫生態(tài)位，我們稱之為腺相關(guān)淋巴生態(tài)位 (GALN)定硝。 了解 SMG 的免疫機制有助于了解疾病皿桑，因為 SMG 中漿細胞數(shù)量增加已在吸煙者、COPD 和川崎病中顯示

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• 注：(d) Number of B lineage cells with different Ig isotypes in airway (trachea & bronchi) from the analysis of VDJ amplified libraries. (e) Percentages of different isotypes of B and plasma cells from the nasal and tracheal brushes of COVID-19+ and healthy control patients. Patients with over 20 B and plasma cells were considered. (f) Visium ST results show IgA plasma cells specific localisation in the glands. H&E on bronchi with manually annotated gland regions shown in blue, Cell2location density scores for IgA-plasma cells, and normalised average cell abundance (dot size and color) for SMG cell types and B lineage cell types across the manually annotated regions in the Visium data. (g) Multiplex IHC staining of human trachea for the SMG structure (Hoechst for nuclei, EpCAM for epithelium, Phalloidin for actin, CD31 for vessels), B lineage markers (IgD, IgA2, IgG) and CD4 T-cells (CD45, CD3, CD4). Arrows point to CD45+CD3+CD4+ cells. Scale bar 100 μm.

Cell-cell interactions and the SMG immune cell niche

為了了解 SMG 中 B 細胞蔬啡、IgA 漿細胞和 T 細胞的共定位诲侮，我們探索了支持 SMG 作為潛在免疫生態(tài)位的分子機制。 我們報告說 pIgR 的表達促進了聚合 Ig 跨表面上皮的轉(zhuǎn)胞吞作用箱蟆，在所有 SMG 上皮細胞中都很高沟绪，粘膜上皮趨化因子 (MEC)/CCL28 也是如此，已知它通過 CCR10 在其他粘膜部位招募 IgA 漿細胞空猜。 使用細胞間相互作用分析工具 CellChat 分析來自氣道的細胞绽慈，我們發(fā)現(xiàn)恨旱，除了 SMG 細胞和 B 漿細胞（結(jié)合 IgA、IgG 和漿母細胞）之間的 CCL28-CCR10 軸外坝疼，預測 SMG-Duct 細胞與 CCR6 通過 CCL20 在記憶和初始 B 細胞和 CD4 T 細胞（組合 CD4 subset搜贤，不包括 Treg）上進行。
Cellchat 還預測了 SMG 上皮細胞（特別是 SMG-Duct 細胞）和 CD4-T 細胞表達的 HLA 基因之間的相互作用钝凶。 SMG-Duct 細胞中 HLA-DRA 和 HLA-DRB1 的表達與纖毛細胞相當仪芒，并且正如預期的那樣，低于 B 記憶和幼稚細胞耕陷。有趣的是掂名，我們觀察到 IHC 在腺體中強烈表達 HLA-DR 蛋白，但在表面上皮細胞中沒有觀察到哟沫，表明轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平之間存在差異饺蔑。我們還在 SMG 上皮細胞中發(fā)現(xiàn)了 CD40 的表達，CD40 是 APC-T 細胞相互作用的關(guān)鍵共刺激分子南用。這兩種因子的表達表明 SMG-Duct 細胞可以將抗原呈遞給 CD4 T 細胞膀钠。先前已在氣道和鼻上皮細胞中觀察到 HLA-DR 和 CD40 的表達，從而促進體外 T 細胞增殖裹虫。有趣的是肿嘲，在唾液腺導管而非其他細胞中觀察到 CD40 表達，并且在干燥綜合征（一種全身性自身免疫性外分泌仓）中表達上調(diào)
為了進一步支持免疫生態(tài)位雳窟，增殖誘導配體 (APRIL) 是 B 細胞存活、分化和類別轉(zhuǎn)換的重要因素匣屡，由 SMG-Duct 細胞表達封救，并在較小程度上由 SMG-漿液細胞表達。根據(jù)受體 TACI 和 BCMA 的差異表達捣作，預測了 SMG 上皮細胞與 B 記憶和 B 漿細胞之間通過這些配體的細胞間通訊誉结。在結(jié)腸中，可以在腸上皮細胞上誘導 APRIL 表達并導致局部組織環(huán)境中的 IgA2 類轉(zhuǎn)換重組 (CSR)券躁。我們還發(fā)現(xiàn)一部分 B 記憶細胞表達激活誘導的胞苷脫氨酶 (AIDCA)惩坑，表明 SMG 通過 TACI-APRIL 信號傳導局部 CSR 的可能性。 SMG-Duct 和在較小程度上 SMG-Serous 細胞表達 IL-6也拜，預測其與 B 血漿上的 IL-6R/IL-6ST 和 CD4-T 細胞subset（CD4-naive/CM）相互作用T細胞以舒。 IL-6 與 APRIL 結(jié)合使用，可誘導和支持長壽命漿細胞慢哈，并且是 IgA 定向漿細胞中 IgA 分泌的有效誘導劑蔓钟。此外，IL-6 已被證明是 CD4 T 細胞記憶形成和克服 Treg 介導的抑制的必需因素卵贱。唾液腺上皮細胞已顯示以 IL-6 依賴性方式誘導 CD4 T 細胞分化為 Tfh 細胞滥沫，從而誘導 B 細胞增殖侣集。在這項研究中，僅在與唾液腺上皮細胞共培養(yǎng)時也誘導了 B 細胞的增殖兰绣，這表明存在額外的 T 非依賴性機制肚吏。 IL-6 在哮喘和 COPD 患者的血清和支氣管肺泡灌洗液中上調(diào)，表明 SMG 中 IL-6 信號的平衡對疾病很重要

In conclusion, we have identified the localisation of IgA plasma cells, naive/memory B cells and T cells at the SMG along with a large number of molecular signalling pathways involved in B lymphocyte recruitment, antigen presentation and both T cell-dependent and -independent maturation and survival. These pathways are known to be functional in other secondary lymphoid organs, including within MALT, and we now show their possible involvement in establishing and maintaining the GALN of the lung.

Summary and Conclusions

我們已經(jīng)對人肺中細胞類型的轉(zhuǎn)錄組進行了詳細注釋狭魂； 評估它們沿氣管支氣管樹和薄壁組織的不同位置。 在提供的 193,000 多個高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組中党觅，我們確定了 77 種細胞類型或狀態(tài)雌澄，其中首次包括軟骨細胞、外周神經(jīng)細胞和 SMG 導管細胞的轉(zhuǎn)錄組杯瞻，以及Schwann細胞镐牺、肌肉和巨噬細胞的subset。 在新發(fā)現(xiàn)的細胞類型中魁莉，我們發(fā)現(xiàn)了在成纖維細胞睬涧、平滑肌和巨噬細胞區(qū)室中表達特定趨化因子組的特化細胞類型。 我們還在氣道黏膜下腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個新的 IgA 免疫細胞生態(tài)位旗唁，我們將其稱為腺體相關(guān)淋巴生態(tài)位 (GALN)畦浓，具有潛在的疾病相關(guān)性。
這項研究的優(yōu)勢在于結(jié)合了多種互補技術(shù)：scRNAseq检疫、scRNAseq讶请、VDJ 分析和空間轉(zhuǎn)錄組學。 盡管 snRNAseq 在檢測到的基因數(shù)量上比 scRNAseq 更有限屎媳，但不會受到酶處理和解離假象的影響夺溢。 這使我們能夠定義軟骨細胞和軟骨膜成纖維細胞 (PC-Fibro) 的轉(zhuǎn)錄組，并分離稀有細胞類型烛谊，如Schwann細胞subset和神經(jīng)相關(guān)成纖維細胞 (NAF)风响。 Visium ST 使我們能夠展示組織內(nèi)細胞類型的定位； 確認那些已知的（如纖毛上皮細胞）丹禀，那些以前在轉(zhuǎn)錄上未定義的如軟骨細胞状勤，以及人肺中完全未描述的細胞類型。
我們表征了可能合作在 SMG 產(chǎn)生免疫生態(tài)位的細胞類型湃崩，發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)荧降、MALT 和免疫活性組織（如腸道）中也觀察到的信號通路，導致 T 細胞依賴性和獨立 B 細胞反應攒读。我們提出了 SMG 上皮細胞之間的細胞 - 細胞相互作用朵诫，包括 SMG-Duct 細胞、CD4-T 細胞和 B-naive薄扁、-memory 和 IgA 分泌漿細胞剪返，我們映射到 SMG废累。 B 譜系細胞的存活、成熟和潛在的類別轉(zhuǎn)換得到 APRIL 和 IL-6 的支持脱盲，由 SMG-Duct 細胞表達邑滨，提供 T 細胞獨立因子。此外钱反，SMG 上皮細胞具有通過表達 MHC-II 和 CD40 誘導 T 細胞依賴性免疫和 B 細胞反應的潛在能力掖看。進一步的功能分析將不得不調(diào)查我們的發(fā)現(xiàn)，檢查我們檢測到的 T 細胞的作用面哥，并測試 SMG-Duct 細胞作為專業(yè) APC 的功能以及在這些位點促進類別轉(zhuǎn)換重組和somatic hypermutation的功能哎壳。
我們描述的許多信號通路已經(jīng)在其他組織中觀察到，并且特別詳細地描述了將 IgA 漿細胞募集到乳腺和腸道的Peyer’s patches尚卫。 在氣道中沒有觀察到健康肺組織內(nèi)的此類次級淋巴結(jié)構(gòu)或通路归榕，但我們假設 SMG 微環(huán)境可能具有類似的功能。

總體而言吱涉，本文提供的多組學數(shù)據(jù)提供了人肺內(nèi)細胞類型和狀態(tài)的全面視圖刹泄，包括宏觀和微觀解剖細胞定位信息。 我們展示了對肺內(nèi)外的許多疾病狀況具有潛在影響的新細胞類型怎爵，并通過計算分析了細胞相互作用特石，促進了我們對肺組成和免疫的理解。 這種綜合分析使我們能夠采用一種系統(tǒng)方法疙咸，該方法開始將器官功能定義為來自不同區(qū)室的細胞之間相互作用的結(jié)果县匠。 在新定義的 GALN 上觀察到的相互作用可能與其他 IgA 分泌位點有關(guān)，例如乳腺撒轮、唾液腺和淚腺乞旦。

我們的發(fā)現(xiàn)可能與傳染病生物學高度相關(guān)，因為 IgA 分泌對于對抗傳染性病原體（如 SARS-CoV-2）至關(guān)重要题山。我們報告了 COVID-19 患者氣道中更高比例的 IgA 漿細胞兰粉，支持 IgA 免疫生態(tài)位的重要性。鼻用疫苗可能會引起強烈的局部 sIgA 反應顶瞳，但目前所有獲得許可的 COVID-19 疫苗都是肌肉注射的玖姑。這些疫苗在預防嚴重疾病方面非常有效，但臨床前研究表明慨菱，它們對防止病毒復制和上呼吸道脫落的保護作用很小焰络。由于誘導上呼吸道和下呼吸道的粘膜 IgA 反應，正在開發(fā)的新型鼻疫苗在非human靈長類動物中顯示出有希望預防病毒的復制和脫落符喝。在human中是否也是如此仍有待確定闪彼，但在 COVID-19 患者中，與 IgM 或 IgG 相比，SARS-CoV-2 中和與 IgA 的相關(guān)性更密切畏腕，并且在眼淚缴川、鼻液和唾液中觀察到 IgA 滴度增加進一步強調(diào)了 IgA 免疫生態(tài)位在 COVID-19 免疫中的重要性。更好地了解粘膜 IgA 免疫生態(tài)位和建立該生態(tài)位的途徑（我們在此描述）可能會提供增強這種免疫反應的選擇描馅。

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• 注：Cell-cell signaling at submucosal gland for B cell recruitment and survival niche. (a) Expression of PIGR and CCL28 in epithelial cells. (b) CellChat cell-cell interaction analysis pathways for CCL chemokines present from SMG epithelial cells to B cells (memory, naive and IgA/IgG/plasmablast combined) or CD4-T cells (CD4-naive/CM, CD4-EM/Effector and CD4-TRM combined) within airway tissue (trachea and bronchi). Arrow direction denotes chemokine-receptor pairs on specific cell types, arrowhead thickness reflects the relative expression of chemokine signal from each cell type. (c-d) Expression dot plot of relevant chemokines and corresponding receptors as shown in (b). (e) CellChat analysis as in (b) showing signalling from HLA genes expressed by SMG epithelial cells, signaling to CD4 on CD4-T cells. Arrow direction denotes ligand-receptor pairs on specific cell types, arrowhead thickness and proportion of the circle by each HLA gene/SMG epithelial cell type reflects the relative expression. (f) RNA expression of HLA-DRA, HLA-DRB1 and CD40 in B cells (as professional antigen presenting cell controls), ciliated and SMG epithelial cells from sc/snRNAseq. (g) Protein staining of HLA-DR and EpCAM in human trachea showing strong expression of HLA-DR in the SMG. (h-i) CellChat analysis as in (b) and (e) showing signalling of APRIL and IL-6 from SMG epithelial cells to relevant B cell subsets and CD4-naive/CM. Arrow direction denotes ligand-receptor pairs on specific cell types, arrowhead thickness and proportion of the circle for each gene/cell type reflects the relative expression. (i) Expression dot plot of relevant ligands and corresponding receptors as shown in (h). (j) Schematic of SMG immune niche showing immune cell recruitment and extravasation facilitated by venous endothelial cells and IR-Ven-Peri and signaling patterns between SMG gland epithelial cells, CD4-T cells, B-naive/memory cells and B-plasma cells to attract immune cells and promote antigen-specific T cell dependent and T cell independent pathways leading to IgA secretion at the SMG.

Method

Spatial mapping of cell types using Visium Spatial Transcriptomics and cell2location（單細胞空間聯(lián)合）

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Single cell and nuclei RNA-seq analysis

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BCR and TCR analysis from VDJ-data

VDJ analysis was done with Scirpy 0.6.0 (http://www.reibang.com/p/7ade4e36701d). For TCR data, clonotypes were defined based on CDR3 nucleotide sequence identity. For BCR data, clonotypes were defined based on the Hamming distance between CDR3 amino acid sequences with a cutoff of 2 and orphan VJ chains removed. In both cases, V gene identity was required and the CDR3 sequence similarity was evaluated across all of a cell pair’s V(D)J chains.

Poisson linear mixed model for cell type composition analysis

Poisson regression with various metadata as covariates was applied to adjust confounding effects on the cell type count data as previously describe. We used Location as biological factor and Protocol, Material
(scRNAseq vs snRNAseq) and Donor as technical factors in the model as random effects to overcome the collinearity.

Cell-cell interaction analysis

Cell-cell interaction from scRNAseq data was predicted using CellChat (Jin et al. 2021). B plasma subsets were combined (B-plasma) and cell types of interest (B-naive, B-memory, SMG-Duct, SMG-Mucous, SMG-Serous, CD4-naive/CM, CD4-EM/Effector and CD4-TRM) were downsampled to 200 cells per cell type per donor. Analyses were performed both with individual CD4-T cell subsets and all CD4 subsets combined. Normalised count matrix along with cell annotation metadata was processed through the standard CellChat pipeline, except that the communication probability was calculated with a truncated mean of 10%.

最后看看補充圖

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生活很好把夸，有你更好